Введение
1. Обзор литературы 15
1.1. Характеристика транскрипционного комплекса РНК-полимеразы II 15
1.2. Базальные транскрипционные факторы II класса 21
1.3. ТАТА-боксы промоторов генов эукариот 24
1.4. Взаимодействие ТСБ с ТАТА-боксами 29
1.5. Однонуклеотидные полиморфизмы ТАТА-боксов и их ассоциация с наследственными заболеваниями человека 37
1.6. Формирование электронной библиотеки и компьютерный анализ неаннотированных однонуклеотидных полиморфизмов ТАТА-боксов промоторов генов липидного гомеостаза человека 57
2. Материалы и методы 62
2.1. Формирование библиотеки неаннотированных SNPs TATA-боксов промоторов генов липидного метаболизма человека 62
2.2. Наработка, выделение и очистка ТСБ 63
Выделение ТАТА-связывающего белка человека 64
Электрофорез по Лэммли 68
Анализ активности белка 69
2.3. Получение меченых 32Р олигодезоксирибонуклеотидов 69
2.4. Определение кинетических и термодинамических характеристик комплексов ТСБ/ОДН методом задержки ДНК в геле 72
2.5. Определение кинетических констант комплексов методом флуоресцентной спектроскопии в режиме реального времени 75
2.6. Разработка плазмидных конструкций для определения активности репортерного гена LUC 80
Очистка образцов ДНК с помощью гель-фильтрации на Sephadex G100 Получение репортерных конструкций 85
Выделение геномной ДНК 86
Получение фрагментов ДНК с использованием ПЦР 86
Гидролиз и лигирование фрагментов ДНК 87
Приготовление электрокомпетентных клеток Е.coli 88
Трансформация клеток Е.coli 88
Подтверждение наличия клонированного фрагмента ДНК с помощью секвенирования 90
Очистка плазмидной ДНК центрифугированием в двуступенчатом градиенте хлористого цезия 94
Трансформация клеточных линий и измерение активности люциферазы 94
3. Результаты и обсуждение 96
3.1. Определение кинетических характеристик комплексов ТСБ/ТАТА анцестральных и минорных аллелей с помощью метода EMSA 106
3.2. Анализ термодинамических характеристик комплексов ТСБ/ТАТА анцестральных и минорных аллелей 115
3.3. Определение в режиме реального времени кинетических характеристик комплексов ТСБ с ТАТА-содержащими олигонуклеотидами, методами остановленной струи и резонансного переноса энергии 120
3.4. Изучение влияния анцестральных и минорных аллелей генов LEP и CYP2A6, на экспрессию репортерного гена LUC 141
3.5. Анализ возможного фенотипического проявления SNPs в ТАТА – боксах промоторов генов 143
Заключение 144
Благодарности 149
Список литературы 150
Приложение 1 182
Приложение 2 184
Приложение 3 185
Приложение 4 186
Приложение 5 187
