Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. История и опыт применения МСК 13
1.2. Характеристика МСК 15
1.2.1. Оценка характеристик МСК 15
1.2.2 Клоногенность 16
1.2.3. Мультипотентность 17
1.2.4. Самообновление в культуре 18
1.2.3. Фенотипирование МСК 18
1.3 Свойства МСК 20
1.3.1 Противовоспалительные и иммуномодулирующие свойства 20
1.3.2 Выделение трофических факторов 22
1.4. МСК и опухоль 23
1.4.1. Онкогенные свойства МСК. 24
1.4.2. Противоопухолевые свойства МСК 25
1.4.3 Иммуномодулирующие онкогенные свойства МСК 25
1.4.4. Хоуминг МСК 26
1.5. Генная терапия 27
1.5.1 Противоопухолевые агенты 28
1.5.2 Введение генов 32
1.6.Система ЦДА/5-ФЦ 35
1.7 Лизомустин 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 39
2.1.Культуры клеток, методы культивирования и получения 39
2.1.1. Культуры клеток 39
2.1.2 Культивирование клеток 39
2.1.3. Выделение МСК 39
2.2. Оценка биологических свойств МСК 40
2.2.1. Иммунофенотипирование МСК 40
2.2.2. Дифференцировка МСК
2.2.2.1. Адипогенная дифференцировка 40
2.2.2.2. Остеогенная дифференцировка 41
2.2.3. Оценка миграционной способности МСК in v itro 41
2.3. Создание плазмидных конструкций 42
2.3.1. Клонирование плазмидных конструкций 42
2.3.2. Выделение плазмидной ДНК для трансфекции 43
2.4. Методы доставки, плазмидных и лентивирусных конструкций 44
2.4.1.Электропорация 44
2.4.2. Химическая трансфекция 44
2.4.2.1. Химическая трансфекция с помощью Xreme GENE HP DNA (Ro c he) 44
2.4.2.2.Химическая трансфекция с помощью Polyethylenimine (PEI, Sigma) 45
2.4.2.3.Химическая трансфекция с помощью Lipofectamine 3000 (Invitrogene) 45
2.4.3. Вирусная инфекция МСК 46
2.4. Методы оценки экспрессии генов 46
2.4.1. Вложенная ПЦР (Nested PCR) 46
2.5. Оценка чувствительности клеток к воздействию 5-ФЦ, 5-ФУ или системы ЦДА UPRT/5-ФЦ 47
2.5.1. Оценка чувствительности клеток к воздействию 5-ФЦ и 5-ФУ 47
2.5.2. Оценка цитотоксического воздействия системы ЦДА-UPRT/5-ФЦ 47
2.6. Методы оценки динамики изменения содержания МСК в тканях опухоли in vivo .48
2.6.1. Оценка динамики изменения содержания МСК по люциферазной активности в лизатах опухолевой ткани 48
2.6.2 Анализ динамики изменения содержания МСК с помощью метода биолюминесцентного in v iv o имиджинга 49
2.7. Перевиваемые опухоли мышей, методы их трансплантации и оценки противоопухолевого эффекта 49
2.7.1. Лабораторные животные 49
2.7.2. Модели опухолевого роста 50
2.7.3. Методы оценки противоопухолевого эффекта 51
2.8.Статистическая обработка 51
ГЛ АВ А 3. Резул ьтаты исследований 53
3.1 Характеризация мезенхимальных стволовых клеток 53
3.1.1. Иммунофенотипирование МСК 53
3.1.2. Дифференцировка МСК in vitro 54
3.1.3. Оценка миграционной активности МСК in v it ro 55
3.2. Создание плазмидных конструкций, отработка методик их введения, 57
получение трансфицированных МСК 57
3.2.1. Получение плазмидных конструкций, несущих гены ЦДА-UP RT и ЦДА-UP RT-VP22 57
3.2.2. Сравнительная химическая трансфекция 58
3.2.3.Электропорация 60
3.3. Оценка экспрессии терапевтических генов 63
3.3.1. Экспрессия гена ЦДА-UPRT в МСК 63 3.3.2. Экспрессия гена ЦДА в HEK293T 64
3.4. Оценка чувствительности клеток к 5-ФЦ и 5-ФУ 65
3.5. Оценка цитотоксического эффекта системы ЦДА-UPRT/5-ФЦ in vitro 67
3.5.1. Оценка цитотоксической активности системы ЦДА-UPRT/5-ФЦ, при монокультивировании 68
3.5.2. Оценка опосредованного цитотоксического эффекта системы ЦДА-UPRT/5-ФЦ,
при совместном культивировании 73
3.6. Оценка динамики изменения содержания МСК в тканях опухоли in vivo 77
3.6.1. Анализ люциферазной активности в лизатах опухоли. 77
3.6.2. Биолюминесцентный анализ динамики изменения содержания МСК в опухоли LLC (биолюминесцентный in v iv o имиджинг).. 79
3.7. Оценка противоопухолевого эффекта модифицированных МСК на моделях меланомы B16 и аденокарциномы легких Льюис LLC 81
3.7.1. Противоопухолевый эффект генетически модифицированных МСК на модели мышиной меланомы B16 82
3.7.1.1. Противоопухолевый эффект МСК, продуцирующих ЦДА-UP RT и ЦДА-UPRT-VP22, на модели мышиной меланомы B16 82
3.7.1.2. Противоопухолевая активность МСК, продуцирующих ЦДА-UP R T в комбинации с лизомустином на модели мышиной меланомы B16 85
3.7.2. Противоопухолевая активность генетически модифицированных МСК на
модели аденокарциномы легких Льюис LLC 87
3.7.2.1. Противоопухолевая активность МСК, продуцирующих ЦДА-UPRT и ЦДА-UPRT-VP22, на модели аденокарциномы легких LLC 87
3.7.2.2. Противоопухолевый эффект МСК, продуцирующих ЦДА-UPRT, в комбинации с лизомустином на модели аденокарциномы легких Льюис LLC 89
Заключение 92
Выводы 103
Список литературы
