Введение
1. Введение 5
1.1. Актуальность работы 5
1.2. Цели и задачи исследования 9
1.3. Научная новизна и практическая значимость .9
1.4. Личный вклад соискателя .10
1.5. Положения, выносимые на защиту 10
1.6. Степень достоверности и апробация результатов .10
2. Обзор литературы 14
2.1. История открытия никотинамидадениндинуклеотида (NAD) .14
2.2. Роль NAD в метаболизме клетки 14
2.3. Роль NAD в клеточном сигналинге
2.3.1. АDP-рибозилирование белков .18
2.3.2. NAD-зависимое деацетилирование белков .23
2.3.3. Мобилизация кальция
2.4. Биосинтез NAD 27
2.5. Метаболизм нуклеотидов 29
2.5.1. Цитозольные 5 -нуклеотидазы человека 31
2.5.2 Переносчики нуклеозидов 33
3. Материалы и методы .37 3.1. Материалы .37
3.2. Культивирование клеток человека и трансфекция 37
3.3. Создание экспрессионных векторов 38
3.4. Измерение внутриклеточного NAD 38
3.5. ЯМР-спектроскопия 38
3.6. Определение концентрации белка, электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях и иммуноблоттинг .39
3.7. Иммуноцитохимия .39
3.8. Очистка белков, слитых с 6xHis, при помощи аффинной хроматографии .40
3.9. Измерение 5 -нуклеотидазной активности 3.10. Измерение кинетических параметров 5 -нуклеотидазных реакций .41
3.11. ВЭЖХ 41 4. Результаты и обсуждение .43
4.1. Клетки человека конвертируют никотиновую кислоту в рибозид никотиновой кислоты, который затем выходит из клеток в питательную среду 43
4.1.1. Оптимизация метода детекции и количественного анализа метаболитов NAD в питательной среде методом ЯМР-спектроскопии 43
4.1.2. Клетки человека выделяют в питательную среду рибозид никотиновой кислоты 46
4.2. Цитозольные 5 -нуклеотидазы CN-IA, CN-II и CN-III синтезируют нуклеозид NAR в клетках человека 48
4.3. CN-II и CN-III дефосфорилируют мононуклеотиды NMN и NAMN c образованием нуклеозидов NR и NAR in vitro .51
4.4. Нуклеозид NAR, вышедший из одних клеток человека, может выступать в роли предшественника NAD в других клетках, не способных использовать Nam и NA для синтеза NAD 59
4.5. Импорт нуклеозидов NR и NAR в клетки человека может осуществляться при помощи белков семейств ENT и CNT 66
4.5.1. Анализ стабильности нуклеозидов NAR и NR в различных биологических жидкостях 66
4.5.2. Изучение механизма импорта нуклеозидов NR и NAR в клетки человека 68
5. Заключение .74
6. Выводы 75
Список сокращений и условных обозначений .76
Список использованной литературы .
