Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Ген RIL 14
1.2. RIL как представитель PDZ/LIM-доменных белков 15
1.2.1 Особенности PDZ-доменов и PDZ-доменных белков 16
1.2.2. Особенности LIM-доменов и ЫМ-доменных белков 18
1.3. Репертуар взаимодействий белка RIL 20
1.4. Взаимосвязь RIL с процессами злокачественной трансформации клеток
1.4.1. Корреляция уровня экспрессии RIL со статусом рецепторов прогестерона и эстрогена 23
1.4.2. Корреляция уровня экспрессии RIL со степенью дифференцировки клеток опухоли 24
1.4.3. Корреляция уровня экспрессии RIL с другими параметрами РМЖ 25
1.4.4. Корреляция уровня экспрессии RIL с подтипом РМЖ в рамках модели РСК 28
1.4.5 Значение c-Src и RIL в развитии и характеристике рака молочной железы 1.5. Экспрессия c-Src как клиническая характеристика рака молочной железы 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы 41
2.1. Работа с культурами эукариотических клеток 41
2.1.1. Клеточные линии, использованные в работе 41
2.1.2. Условия культивирования 43
2.1.3. Пересев адгезионных культур 43
2.1.4. Замораживание и размораживание эукариотических клеток 44
2.1.5. Оценка скорости пролиферации клеток 44
2.1.6. Оценка миграционной активности клеток 45
2.2. Молекулярно-биологические методы 45
2.2.1. Выделение тотальной РНК из клеток 45
2.2.2. Определение концентрации РНК/ДНК в растворе 47
2.2.3. Электрофоретическое разделение РНК/ДНК в агарозном геле 47
2.2.4. Обратная транскрипция 48
2.2.5 Анализ уровней экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени 48
2.3. Работа с плазмидной ДНК и клонирование 53
2.3.1. Получение химически компетентных клеток Е.coli 53
2.3.2. Трансформация химически компетентных клеток Е.coli 53
2.3.3. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК 54
2.3.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции 54
2.3.5. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей 55
2.3.6. Лигирование ДНК 55
2.3.7. Векторы и плазмидные конструкции, использованные в работе 56
2.3.8. Трансфекция 59
2.3.9. Упаковка лентивирусных частиц 59
2.3.10. Очистка вирионов и трансдукция 60
2.4. Методы выделения и анализа белков 61
2.4.1. Анализ содержания белков в исследуемых клетках методом Вестерн-блоттинг 61
2.4.2. Определение активности киназы с-Src 64
2.4.3. Иммунофлуоресцентный анализ 65
2.5. Селекция модифицированных аптамеров к CD47 методом Cell-SELEX 67
2.5.1 Случайные ДНК-библиотеки и праймеры 67
2.5.2 Процедура SELEX на клетках 68
2.5.3 Определение связывающей способности одноцепочечных ДНК-аптамеров обогащенного пула после каждого раунда 69
2.5.4 Селекция клонов и секвенирование 69
2.5.5 Сравнение последовательностей и анализ вторичных структур аптамеров 69
2.5.6 Результаты проведения раундов селекции 70
2.6. Статистический анализ полученных данных 71
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 73
3.1. Анализ уровня экспрессии RIL в ряду линий рака молочной железы 73
3.2. Подавление и повышение экспрессии RIL в ряду линий РМЖ 75
3.3. Анализ миграционной активности RIL (+) и RIL (-) линий РМЖ 78
3.4. Анализ гипотезы PDLIM4-опосредованной инактивации Src киназ 80
3.5. Секвенирование транскриптомов трансгенных линий и анализ полученных результатов 84
3.6. Анализ взаимосвязи RIL с моделью CD-74 – опосредованного развития РМЖ 88
3.7. Анализ корреляции экспрессии RIL с CD44 и CD47 93
3.8. Анализ внутриклеточной локализации RIL 95
Заключение 98
Выводы
