Введение
1 Введение 6
1.1 Актуальность темы исследования 6
1.2 Цель и задачи исследования 8
1.3 Научная новизна 9
1.4 Теоретическая и практическая значимость работы 10
1.5 Методология и методы исследования 10
1.6 Положения, выносимые на защиту 10
1.7 Степень достоверности и апробация результатов 11
2 Обзор литературы 12
2.1 Экстремофильные белки 12
2.1.1 Белки гипертермофильного происхождения 13
2.1.2 Применение термофильных/гипертермофильных белков 16
2.2 Рибосомальные белки: белки L35Ae 18
2.2.1 Рибосомальные белки 18
2.2.2 Рибосомальный белок L35Ae (eL33) 20
2.3 Специфично связывающие белковые молекулы и их комбинаторные библиотеки 23
2.3.1 Системы селекции из комбинаторных библиотек специфично связывающих белков 24
2.3.2 Метод фагового дисплея. Основные принципы 28
2.4 Антитела 35
2.4.1 Иммуноглобулины. Классификация, строение и применение иммуноглобулинов 35
2.4.2 Фрагменты иммуноглобулинов 39
2.4.3 Комбинаторные библиотеки на основе фрагментов иммуноглобулинов. Применение фрагментов иммуноглобулинов 41
2.5 Альтернативные каркасные белки 45
2.5.1 Искусственно созданные альтернативные каркасные белки 51
2.5.2 Альтернативные каркасные белки на основе природных белковых молекул и библиотеки на их основе 52
2.5.3 Альтернативные каркасные белки, полученные на основе белковых
структур экстремофильного происхождения 60
2.5.4. Применение альтернативных связывающих белков 64
3 Материалы и методы 68
3.1 Материалы 68
3.1.1 Химические реактивы и реагенты, ферменты и белковые препараты 68
3.1.2 Буферные растворы 68
3.1.3 Среды 69
3.1.4 Бактериальные штаммы и векторы 69
3.1.5 Клеточные линии млекопитающих 70
3.1.6 Рекомбинантные гены и праймеры 70
3.1.7 Прочие расходные материалы 74
3.2 Методы 74
3.2.1 Получение мутантных форм L35Ae и анализ их структурных свойств 74
3.2.1.1 Расчет энергии электростатических взаимодействий в rWT L35Ae и его мутантных формах 74
3.2.1.2 Электрофорез в геле агарозы 74
3.2.1.3 Получение мутантных форм на основе rWT L35Ae: L35Ae 6X и L35Ae 10X 75
3.2.1.4 Экспрессия и выделение рекомбинантных L35Ae методами металл-аффинной и ионообменной хроматографии 76
3.2.1.5 Определение вторичной структуры рекомбинантных L35Ae методом кругового дихроизма 78
3.2.1.6. Определение термостабильности рекомбинантных L35Ae методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии 78
3.2.1.7 Изучение устойчивости рекомбинантных L35Ae к денатурации гуанидин гидрохлоридом 79
3.2.1.8 Изучение олигомеризации и агрегации рекомбинантных L35Ae методом химического «сшивания» глутаровым альдегидом 80
3.2.1.9 Изучение олигомеризации и агрегации рекомбинантных L35Ae методом динамического рассеяния света 80
3.2.1.10 Гель-фильтрация образцов L35Ae 81
3.2.1.11 Исследование взаимодействия рекомбинантных L35Ae с клеточной линией млекопитающих HEK 293 81
3.2.2 Конструирование и сборка комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X и оценка ее функциональности 82
3.2.2.1 In silico анализ и выбор потенциальных сайтов рандомизации L35Ae 10X 82
3.2.2.2 Конструирование, сборка и амплификация комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X 82
3.2.2.3 Характеризация комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X 84
3.2.2.4 Селекция клонов, специфичных к лизоциму куриного яйца, из комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X 85
3.2.2.5 Непрямой иммуноферментный анализ поликлональных и моноклональных фаговых частиц из комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X, обогащенной на лизоциме куриного яйца 86
3.2.2.6 Клонирование в растворимом формате АСБ L4 и L7 87
3.2.2.7 Экспрессия и выделение АСБ L4/L7 и L35Ae 10X-myc 88
3.2.2.8 Определение активности препаратов АСБ L4 и L7 методом непрямого иммуноферментного анализа 89
3.2.2.9 Сравнение устойчивости рекомбинантных АСБ L4/L7 и L35Ae 10X-myc к денатурации гуанидин гидрохлоридом 90
3.2.2.10 Сравнение склонности к олигомеризации и агрегации АСБ L4/L7 и L35Ae 10X-myc методом химического «сшивания» глутаровым альдегидом
3.2.2.11 Определение равновесных констант диссоциации АСБ L4 и L7
методом поверхностного плазмонного резонанса 90
4 Результаты и их обсуждение 92
4.1 Оптимизация структуры rWT L35Ae 92
4.1.1 Структурные свойства rWT L35Ae 94
4.1.2 Изучение взаимодействия rWT L35Ae с клеточной линией млекопитающих HEK293 101 4.1.3 Оптимизация структуры rWT L35Ae методом направленного мутагенеза с целью снижения его взаимодействия с мембранами клеток линии HEK293 и склонности к агрегации 103
4.1.4 Сравнение структурных свойств rWT L35Ae и его мутантной формы L35Ae 10X 106
4.2 Конструирование и сборка комбинаторной фаговой библиотеки вариантов
L35Ae 10X и оценка ее функциональности 109
4.2.1 Сборка и амплификация комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X 112
4.2.2 Характеризация комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X 115
4.2.3 Селекция АСБ к лизоциму куриного яйца из комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X и их характеризация 117
4.2.4 Анализ физико-химических свойств индивидуальных АСБ в растворимом формате, селектированных по сродству к лизоциму куриного яйца 1
5 Заключение 128
6 Выводы 134
7 Список основных сокращений 135
8 Список литературы 138
