Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Общий план строения хемокинов и их рецепторов 14
1.2. Внутриклеточные изменения и пути передачи сигнала при действии хемокинов 16
1.3. Функции хемокинов
1.3.1. Функции CXC-хемокинов и их рецепторов 17
1.3.2. Функции СС-хемокинов и их рецепторов 19
1.3.3. Функции СХЗС- и С-хемокинов и их рецепторов
1.4. Хемокины, их рецепторы и раковые клетки 22
1.5. Роль хемокинов и их рецепторов в прогрессии аутоиммунных патологий на примере рассеянного склероза 26
1.6. Структура и регуляторные элементы гена хемокинового рецептора на примере CXCR5 27
1.7. Белок р53 и его влияние на развитие опухоли 29
1.8. Транскрипционные факторы семейства р53 - р63 и р73 - и их роль в развитии опухоли 32
1.9. Характеристика транскрипционных факторов семейства NFDВ 34
1.10. Взаимная регуляция белков семейства р53 и транскрипционных факторов семейства
NFDB 36
ГЛАВА 2. Материалы и методы 38
2.1. Поиск регуляторных элементов гена CXCR5 при помощи онлайн-сервисов 38
2.2. Методы работы с эукариотическими клеточными культурами
2.2.1. Культивирование клеточных линии MCF-7, ВТ-20, Raji и Daudi 39
2.2.2. Снятие прикрепленных клеток с культуральных планшетов и матрасов 40
2.2.3. Замораживание и размораживание эукариотических клеток 40
2.2.4. Са-фосфатная трансфекция клеток линии НЕК-293Т экспрессионной конструкцией, содержащей ген хемокина CXCL13 41
2.2.5. Трансфекция клеток MCF-7 и ВТ-20 с использованием PEI 41
2.2.6. Электропорация клеток линий Raji, Daudi и MCF-7 42
2.2.7. Хемотактический тест в агарозных каплях (Wiggins et al, 2010) 42
2.2.8. Хемотактический тест с использованием культуральных вставок фирмы Geiner Bio-One 43 2.2.9. Индукция CXCR5-опосредованного сигнального каскада с использованием хемокинаСХСЫЗ 44
2.2.10. Активация В-лимфобластоидных клеток линий Raji и Daudi с использование LPS,
РМА и иономицина 44
2.3. Молекулярно-биологические методы 44
2.3.1. Выделение тотальной РНК из клеток 44
2.3.2. Определение концентрации РНК/ДНК в растворе 45
2.3.3. Горизонтальный электрофорез РНК/ДНК в агарозном геле 46
2.3.4. Синтез первичной цепи кДНК (обратная транскрипция) 46
2.3.5. Анализ уровней экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени 47
2.3.6. Анализ содержания белков в исследуемых клетках методом Вестерн-блоттинг 51
2.3.7. Получение компетентных клеток E.coli (штамм DH5) 52
2.3.8. Трансформация бактериальных клеток (штамм DH5) плазмидной ДНК методом теплового шока 52
2.3.9. Выделение плазмидной ДНК 2.3.9.1. Miniprep с использованием набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit 53
2.3.9.2. Midiprep с использованием набора GeneJET Plasmid Midiprep Kit 53
2.3.10. Создание люциферазных репортерных конструкций 54
2.3.10.1. Общая схема клонирования промотора и энхансера гена CXCR5 в люциферазную репортерную плазмиду pGL3 basic 54
2.3.10.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 56
2.3.10.3. Очистка продуктов амплификации от других компонентов ПЦР-смеси 57
2.3.10.4. Рестрикция фрагментов ДНК 58
2.3.10.5. Реакция лигирования 58
2.3.10.6. Проверка собранных конструкций 58
2.3.10.7. Внесение делеций в промотор гена CXCR5 59
2.3.10.8. Внесение точечных мутаций в потенциальные сайты связывания факторов семейства NFDB, расположенные на промоторе гена CXCR5 61
2.3.10.9. Создание промотора CXCR5, содержащего минорный “А” вариант полиморфизма rs630923 и внесение точечных мутаций в потенциальный сайт связывания транскрипционного фактора MEF2C
2.3.10.10. Создание NFkB-зависимой люциферазной репортерной конструкции 63
2.3.10.11. Тестирование активности конструкций с геном-репортёром Firefly luciferase 64 2.3.11. Определение связывания транскрипционного фактора семейства NFkB p65 с последовательностью промотора CXCR5 in vivo методом хроматиниммунопреципитации (CHIP) 65
2.3.12. Определение связывания транскрипционного фактора MEF2C с фрагментами промотора CXCR5 методом DNA pull-down 67
2.3.13. Инактивация генов p73 и MEF2C с использованием siRNA 69
2.3.14. Инактивация генов p53 и p63 в клетках MCF-7 с использованием системы программируемой геномной нуклеазы CRISPR/Cas9
2.3.14.1. Подбор последовательностей для направляющих РНК (crRNA) 70
2.3.14.2. Интеграция последовательностей для синтеза crRNA в плазмиду px461 73
2.3.14.3. Создание донорных конструкций для внесения кассет, экспрессирующих флуоресцентные белки, в места вносимых Cas9 целевых разрезов 74
2.3.14.4. Электропорация клеток MCF-7 плазмидами для инактивации генов p53 и p63, отбор клеток с отредактированным геномом 75
2.4. Статистический анализ полученных данных 76
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 78
3.1. Роль основного опухолевого супрессора p53 в регуляции активности гена CXCR5 78
3.1.1. Подавление экспрессии p53 в клетках РМЖ человека MCF-7 приводит к увеличению уровня экспрессии CXCR5 и активации CXCL13-индуцируемого сигнального каскада 78
3.1.2. Подавление экспрессии p53 в клетках РМЖ человека MCF-7 приводит к повышению CXCL13-зависисой миграционной активности клеток 81
3.1.3. Предположительные цис-регуляторные элементы гена CXCR5 были идентифиицрованы с использованием биоинформатических баз данных 83
3.1.4. Активность промотора гена CXCR5 увеличивается в 1,4 раза при подавление экспрессии p53 в клетках РМЖ MCF-7, в то время как предположительный энхансер гена CXCR5 повышает ее в среднем на 15 % 85
3.1.5. Участки 3 и 5 играют ключевую роль как в базовой активности промотора, так и в его зависимости от уровня белка p53 в клетках MCF-7 86
3.1.6. Точечная мутация предсказанных сайтов связывания NFkB в промоторе гена CXCR5 приводит к падению базовой активности промотора, а также ее невосприимчивости к уровню белка p53 88
3.1.7. Изменения активности транскрипционных факторов семейства NFkB в клетках РМЖ MCF-7 напрямую влияют на активность промотора гена CXCR5 91
3.1.8. Связывание факторов NFkB с предсказанными сайтами в промоторе CXCR5
подтверждено in vivo, а сила свзяывания демонстрирует обратную зависимость от статуса белка p53 в клетках РМЖ 93
3.2. Роль факторов p63 и p73, гомологов p53, в регуляции активности гена CXCR5 в условиях генотоксического стресса 94
3.2.1. Инактивация гена p53 с использованием системы CRISPR/Cas9 привела к исчезновению мРНК и белка p53, что коррелирует с ростом уровня экспрессии CXCR5 94
3.2.2. Повышение концентрации ДНК-повреждающего агента MMS и времени инкубации с ним приводит к снижению уровня экспрессии CXCR5 как в клетках MCF-7, так и MCF-7-p53off, но в разной степени 96
3.2.3. Инкубация с MMS приводит к подавлению уровня экспрессии CXCR5 как в клетках MCF-7, так и в клетках MCF-7-p53off с инактивированным геном p53, в которых также происходит активация экспрессии генов p63 и p73 99
3.2.4. Инактивация гена p63 с использованием системы CRISPR/Cas9 и гена p73 с помощью siRNA приводит к значительному снижению уровней их экспрессии и их невосприимчивости к генотоксическому стрессу 101
3.2.5. Белки p63 и p73 подавляют экспрессию гена CXCR5 только в клетках MCF-7 с инактивированным p53 и при генотоксическом стрессе 104
3.2.6. Миграционная активность клеток РМЖ MCF-7 по градиенту концентрации хемокина CXCL13 зависит от статуса белков p63 и p73 в клетках MCF-7 с инактивированным p53 и при генотоксическом стрессе 105
3.2.7. Уровень активности промотора гена CXCR5 в нормальных условиях демонстрирует зависимость от статуса белка p53, а при генотоксическом стрессе – от всех белков семейства p53 107
3.2.8. Делеции участков 3 и 5 приводят к полной невосприимчивости промотора CXCR5 к уровню белков p53, p63 и p73 в клетках РМЖ MCF-7 в нормальных условиях и при генотоксическом стрессе 108
3.2.9. Активность транскрипционных факторов семейства NFkB напрямую зависит от статуса белков p53, p63 и p73 в клетках РМЖ человека MCF-7 при генотоксическом стрессе 111
3.2.10. Мутация всех сайтов связывания NFkB в промоторе CXCR5 приводит к невосприимчивости активности промотора к статусу белков p53, p63 и p73 иуровню генотоксического стресса в клетках РМЖ MCF-7 112 3.2.11. Связывание NFkB с сайтами 2 и 3 в промоторе гена CXCR5 напрямую зависит от уровня экспрессии p53, p63 и p73 в клетках РМЖ человека MCF-7 114
3.2.12. Антагонизм систем p53 и NFkB может также лежать в основе регуляции ряда других генов, активных в опухолях, что показано на примере гена кластерина in silico 116
3.3. Роль полиморфизма rs630923, ассоциированного с развитием рассеянного склероза,
в регуляции промотора гена CXCR5 117
3.3.1. Влияние однонуклеотидного полиморфизма rs630923 на уровень активности промотора CXCR5 не связано с активностью NFkB 117
3.3.2. Предположительный сайт связывания транскрипционного фактора MEF2C ассоциирован с минорным “A” вариантом полиморфизма rs630923 в промоторе гена CXCR5 119
3.3.3. Фактор MEF2C демонстрирует связывание с вариантом промотора гена CXCR5, несущим минорный “А” вариант полиморфизма rs630923 119
3.3.4. Наличие функционального сайта связывания транскрипционного фактора MEF2C ассоциированно со сниженной активностью промотора CXCR5 в активированных B-лимфобластоидных клетках линий Raji и Daudi 122
Заключение 127
Выводы 131
Список литературы 132
