Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Общие сведения о рецепторе CD150 (SLAMF1) 11
1.1.1. Рецептор CD150 (SLAMF1) 13
1.1.2. Внутриклеточные пути передачи сигнала рецептора CD150 13
1.1.3. Функции рецептора CD150 1.1.3.1. CD150 является регулятором синтеза IFN-, пролиферации Т- и В-клеток 18
1.1.3.2. Роль SLAMF1 в развитии NKT-клеток 20
1.1.3.3. Распознавание бактерий клеткой при участии CD150 20
1.1.4. Связь нарушения регуляции SLAMF1 и развития заболеваний 22
1.1.4.1. SLAMF1 и аутоиммунные заболевания 22
1.4.2. Полиморфизмы гена SLAMF1, ассоциированные с заболеваниями 23
1.4.3. Роль CD150 в развитии Х-сцепленного лимфопролиферативного синдрома и легочного саркоидоза 25
1.4.4. Уменьшение экспрессии SLAMF1 является плохим прогностическим признаком при лечении хронического лимфолейкоза 27
1.1.4.5. SLAMF1 и туберкулез 27
1.1.5. CD150 может выступать в качестве рецептора для представителей морбилливирусов, и вируса контагиозного моллюска 28
1.2. Общие механизмы регуляции экспрессии генов 31
1.2.1. Регуляция экспрессии белка на уровне транскрипции 31
1.2.1.1 Общие этапы регуляции инициации транскрипции РНК эукариот. 31
1.2.1.2. Эпигенетические изменения, происходящие на протяжении инициации транскрипции 33
1.2.1.3. Регуляторные элементы эукарического гена 34
1.2.1.4. Транскрипционные факторы и биоинформатическое предсказание их связывания 40
1.2.1.5. Транскрипционный фактор EBF1 42
2.2. Регуляция экспрессии белка на уровне трансляции 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы 55
2.1. Методы работы с бактериями E.coli 55
2.1.1. Получение компетентных клеток 55
2.1.2. Трансформация компетентных клеток 56
2. Методы работы с ДНК 56
2.2.1. Выделение плазмидной ДНК (miniprep) 56
2.2.2. Выделение плазмидной ДНК (midiprep) 57
2.2.3. Секвенирование 58
2.2.4. Молекулярное клонирование 59
2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 59
2.2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 60
2.2.7. Сайт-направленный мутагенез 62
2.2.8. Анализ экспрессии генов методом ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени 66
2.3. Методы работы с эукариотическими клетками 67
2.3.1. Культуры клеток, использованные в работе 67
2.3.2. Замораживание клеток 68
2.3.3. Размораживание клеток 68
2.3.4. Ведение культуры прикрепленных клеток 69
2.3.5. Ведение суспензионных клеточных культур 69
2.3.6. Трансфекция клеток методом капиллярной электропорации 69
2.3.7. Люциферазный тест 70
2.4. Методы работы с РНК 71
2.4.1. Выделение тотальной РНК из клеток 71
2.4.2. Синтез первой цепи кДНК (обратная транскрипция) 71
2.4.3. Метод быстрой амплификации концевых фрагментов кДНК (5 RACE PCR) 72
2.4.4. РНК-интерференция 73
2.4.5. Транскрипция мРНК in vitro 74
2.5. Преципитация хроматина 76
2.5.1. Иммунопреципитация хроматина (СhIP) 76
2.5.2. Тест на связывание белка с ДНК-матрицей (DNA pull-down assay) 78
2.6. Биоинформатические методы 79
2.6.1. Поиск предполагаемых промоторной и энхансерных областей, сайтов связывания факторов транскрипции, оценка влияния полиморфизмов на связывание
факторов транскрипции 79
2.6.2. Анализ дифференциальной экспрессии генов 79
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 81
3.1. В В-клетках человека преимущественно экспрессируются мРНК SLAMF1 с короткой 5 -НТО 81
3.2. Эффективность трансляции коротких мРНК SLAMF1 в 6-8 раз выше, чем длинных мРНК 85
3.3. Длинные изоформы мРНК гена SLAMF1 содержат несколько кОРС в 5 -НТО 88
3.4. Трансляция мРНК SLAMF1, содержащих длинные и короткие варианты 5 -НТО, в равной степени угнетается при дефиците активных факторов eIF2 и eIF4E 90
3.5. Описание промоторной области гена SLAMF1 в В-лимфобластоидных клеточных линиях человека 92
3.6. Определение сайтов связывания транскрипционных факторов в промоторе гена SLAMF1 95
3.7. Активность EBF1 в В-клетках ассоциирована с диметилированием лизина 4 гистона 3 (H3K4Me2) 99
3.8. Транскрипционный фактор EBF1 играет значительную роль в регуляции экспрессии различных представителей семейства SLAM 101
3.9. Мутация сайтов связывания EBF1 также оказывает влияние на активность энхансеров локуса гена SLAMF1 1 3.10. Введение сайта связывания EBF1 в промотор Slamf1 мыши увеличивает его активность 105
3.11. Сайт связывания EBF1 разрушается минорным вариантом полиморфизма rs139767239 107
3.12. Полиморфизм rs3753381 увеличивает активность энхансера SLAMF1 более чем в два раза 109
3.13. Мутации сайтов связывания транскрипционных факторов RXR и FOX угнетают активность энхансера Е в случае минорного варианта полиморфизма rs3753381 112
Заключение 116
Выводы 117
Благодарности 117
