Введение
Обзор литературы
Синтез и метаболизм NO
NO-синтазы
Диффузия NO
Окисленные производные NO
Концентрационные эффекты NO
Рецепторы NO
Белки, содержащие гем
Гуанилатциклаза и система cGMP Цитохромоксидаза
Белки, содержащие негемовое железо Аконитаза
Пролилгидроксилазы PHD и FIH и транскрипционный фактор HIF-1
Белки, содержащие активные SH-группы
G-белки семейства Ras
Тиоредоксин
Зависимые от NO сигнальные системы
Протеинкиназы MAP и транскрипционный фактор AP-1 19 19
3.1.1. Структура AP-1 и его участков связывания с ДНК 43
3.1.1.1. Субъединичный состав 45
3.1.1.2. Участки связывания с ДНК 47
3.1.2. Регуляция AP-1 48
3.1.2.1. Протеинкиназные системы 48
3.1.2.2. Регуляция факторов семейств Jun и Fos 50
3.1.2.3. Регуляция факторов семейства ATF/CREB 51
3.1. 3. AP-1 и рецепторы межклеточных сигнальных молекул 52
3.1.3.1. Рецепторы ростовых факторов 52
3.1.3.2. Семейство рецепторов TNF 57
3.1.3.3. Рецепторы IL-1 и TLR 59
3.1.4. Кооперация AP-1 с другими транскрипционными факторами 61
3.1.4.1. Взаимодействия, опосредованные CBP/p300 61
3.1.4.2. Непосредственные контакты AP-1 с другими транскрипционными факторами
3.2. Сигнальная система Keap1/Nrf2 66
3.2.1. Зависимые от Nrf2 защитные системы клеток 66
3.2.2. Регуляция экспрессии защитных генов, фактор Nrf2 68
3.2.3. Регуляция функциональной активности Nrf2 70
3.2.4. Сенсорная функция тиольных групп Keap1 77
3.2.5. Алкилирование тиольных групп Keap1 в условиях in vivo 80
3.2.6. Эффекты электрофильных соединений, несвязанные с индукцией зависимых от Nrf2 генов
3.2.7. Природные соединения активирующие сигнальную систему Keap1/Nrf2
3.2.8. Фармакологическое применение активаторов системы Keap1/Nrf2
Материалы и методы
1. Культура хондроцитов и выделение РНК 94
2. Культуры моноцитарных клеток 95
3. Другие клеточные линии 95
4. Получение ядерной фракции клеток 96
5. Использованные реагенты 96
6. Плазмиды, получение меченых зондов и блот-гибридизация РНК
7. Выделение и электорофорез ДНК 98
8. Вычитающая гибридизация 99
9. Определение N2O3 по флуоресценции DAF 99
10. Определение экспрессии генов с использованием олигонуклотидных микроматриц
11. Количественная ПЦР 101
12. Блот-гибридизация белков 105
13. Трансфекция клеток и экспрессия репортерного гена 105
14. Определение апоптоза в моноцитах методом проточной 106 цитометрии
15. Колориметрическое определение токсичности 107
16. Определение токсичности в бета-клетках 107
17 Определение генерации АФК клетками 107
18. Синтез соединений АМН 108
19. Измерение спектра поглощения конъюгатов АМН и GSH 108
20. Анализ конъюгатов АМН и GSH с использованием хромато- 109 масс-спектроскопии
21. Определение нитрита
22 Определение связанной с белком радиоактивной метки 109
23 Определение секреции инсулина 110
24. Статистический анализ 111
Результаты и обсуждение 112
1. Транскрипционный ответ клеток на действие NO 112
1.1. Экспрессия зависимых от NO генов в первичных хондроцитах
1.2. Экспрессия зависимых от NO генов в моноцитарных клетках
Анализ зависимых от NO сигнальных систем
2.1. Исследование фосфобелков 136
2.2. Ингибиторный анализ сигнальных путей 146
2.3. Особенности индукции гена KLF2 153
3. Модуляция экспрессии генов в присутствии фармакологических соединений, влияющих на метаболизм NO 156
3.1. Применение антиоксидантов для подавления АФА 156
3.2. Фармакологическая стимуляция окисления NO 158
3.3. Умеренная гипоксия и индукция NO-зависимых генов 161
3.4. Внеклеточная каталаза активирует экспрессию генов в культуре хондроцитов
4. Активация экспрессии NO-зависимых и защитных генов при фармакологическом воздействии на регуляторную систему Keap1/Nrf2 170
4.1. Влияние БМН тирфостинов на экспрессию NO-зависимых 170 генов
4.2. Структурно-функциональный анализ соединений АМН 175
4.3. Образование аддуктов в реакции соединений БМН с тиолами 181
4.4. Защитное действие соединений АМН на клетки U937 185
4.5. Защитное действие соединений АМН на бета-клетки
4.5.1. Индукция защитных геновHO-1 и NQO1, активация Nrf2, 197 подавление окислительного стресса
4.5.2. Подавление индукции iNOS и токсического действия про- 209 воспалительных цитокинов
4.6. Подавление ответа бета-клеток на про-воспалительные 217 цитокины в присутствии брусатола
4.7. Симуляция продукции NO в клетках TC6 при их совместном культивировании со стволовыми клетками нервной системы 235
Заключение 238
Краткое изложение результатов исследования 238
1. Спектр зависимых от NO генов 238
2. Зависимые от NO сигнальные пути 239
3. Фармакологическая модуляция ответа клеток на действие NO 239
4. Фармакологическое воздействие на систему Keap1/Nrf2 239
5. Подавление токсического действия про-воспалительных 239 цитокинов на бета-клетки 6. Другие эффекты
Выводы 243
Список сокращений 245
Список публикаций по теме диссертации 249
Список литературы
