Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 19
1.1 Общие сведения о вирусном онколизе и онколитических вирусах 19
1.2 Классификация и свойства энтеровирусов человека 22
1.3 Механизмы проникновения энтеровирусов в клетки 25
1.4 Системы противовирусной защиты клетки и значение их поломок для приобретения чувствительности к онколитическим вирусам 32
1.5 Онколитические свойства энтеровирусов 38
1.6 Перспективы использования энтеровирусов в качестве онколитических средств 52
ГЛАВА 2. Материалы и методы 56
2.1 Материалы и реагенты, использованные в работе 56
2.2 Препараты энтеровирусных штаммов, использованных в работе 59
2.3 Наработка плазмидной ДНК в Echerichia Coli, штамм 10-beta 59
2.4 Разрезание ДНК эндонуклеазами рестрикции 60
2.5 Фракционирование ДНК электрофорезом в агарозном геле 60
2.6 Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля 61
2.7 Лигирование векторной плазмиды с фрагментами ДНК 61
2.8 Проведение ПЦР 62
2.9 Определение чувствительности линий опухолевых клеток к штаммам энтеровирусов
2.10 Определение продуктивности вирусной инфекции в линиях опухолевых клеток путем титрования методом Рида и Менча 65
2.11 Получение ксенографтов опухолей модельных линий клеток в иммунодефицитных мышах 65
2.12 Введение энтеровирусов в организм иммунодефицитных мышей с целью индукции вирусного онколиза 66
2.13 Волюмометрия ксенографтов модельных и первичных линий опухолевых клеток 66
2.14 Получение моноклональных сублиний клеток после трансфекции плазмиды pCas-Guide-2A-RFP 67
2.15 Выделение геномной ДНК 68
2.16 Получение первичных культур опухолевых клеток из клинических образцов 68
2.17 Криоконсервация культур опухолевых клеток 69
2.18 Трансфекция клеток плазмидной ДНК 69
2.19 Клонирование энтеровирусных штаммов методом бляшек 70
2.20 Наработка препаратов энтеровирусов 71
2.21 Выделение плазмидной ДНК 72
2.22 Проведение ПЦР в реальном времени 73
2.23 Детекция белков вирусных рецепторов методом Вестерн блоттинга 74
2.24 Математический анализ взаимосвязи дифференциальной экспрессии генов и чувствительности клеточных линий к вирусам и статистическая обработка данных 75 2.25 Проведение высокопроизводительного секвенирования транскриптомов клеточных линий 76
2.26 Создание плазмид pCas-Guide-2A-RFP для выключения генов 77
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 80
3.1. Анализ структуры генома непатогенного штамма Коксаки В5/ЖЭВ14 80
3.2 Получение первичных культур опухолевых клеток аденокарциномы простаты от пациентов 86
3.3 Оценка онколитических свойств штаммов энтеровирусов на моделях in vitro 89
3.4 Онколитическая активность вирусного штамма ЖЭВ14 на модели подкожных ксенографтов клеток рака предстательной железы в иммунодефицитных мышах .
3.5 Исследование влияния поверхностного рецептора CXADR на заражения вирусом ЖЭВ14 98
3.6 Изучение влияния состояния клеточной системы врожденного противовирусного иммунитета на чувствительность клеток к действию онколитических энтеровирусов 103
3.7 Выявление генов клетки-хозяина, экспрессия которых связана с эффективностью продукции онколитического энтеровируса ЖЭВ14 113
3.8 Исследование влияния нокаута гена STAT2 на чувствительность клеток к онколитическим вирусам 126
Заключение 129
Выводы 132
Благодарности 133
Список литературы 134
