Введение
1 Введение 6
1.1 Актуальность темы исследования 6
1.2 Степень разработанности темы исследования 7
1.3 Цель и задачи 8
1.4 Научная новизна 8
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы 9
1.6 Методология и методы исследования 9
1.7 Положения, выносимые на защиту 9
1.8 Степень достоверности и апробация результатов 10
2 Обзор литературы 13
2.1 Длинные некодирующие РНК и их участие в регуляции экспрессии генов 13
2.1.1 Линейные lncРНК. Особенности структуры и экспрессии 13
2.1.1.1 Разнообразие линейных lncРНК 13
2.1.1.2 Биогенез линейных lncРНК 16
2.1.1.3 Консерватизм линейных lncРНК 18
2.1.1.4 Особенности экспрессии линейных lncРНК 19
2.1.2 Функции линейных lncРНК 20
2.1.2.1 Взаимодействие lncРНК с белками 20
2.1.2.2 Взаимодействие lncРНК с ДНК. Образование тройных спиралей 21
2.1.2.3 Взаимодействие lncРНК с микроРНК. Конкурентные эндогенные РНК 22
2.1.2.4 Функции антисмысловых lncРНК 23
2.1.3 Циклические РНК 24
2.1.3.1 Разнообразие циклических РНК 25
2.1.3.2 Образование циклических РНК 26
2.1.3.3 Консерватизм и особенности экспрессии циклических РНК.. 27
2.1.3.4 Циклические РНК как сорбенты микроРНК 29
2.1.3.5 Иные функции циклических РНК 31
2.2 Особенности гена сфингомиелинсинтазы 1 32
2.2.1 Структура и экспрессия гена SGMS1 человека 33
2.2.2 Паралоги и ортологи гена сфингомиелинсинтазы 1 36
3 Материалы и методы исследования 39
3.1 Выделение РНК из замороженных тканей и крови 39
3.1.1 Подготовка образцов из замороженных тканей 39
3.1.2 Получение ядерной и цитоплазматической фракций РНК 39
3.1.3 Подготовка образцов белых клеток крови 40
3.1.4 Выделение РНК 40
3.1.5 Спектрофотометрическое определение количества РНК 41
3.1.6 Проверка качества препаратов суммарной РНК с помощью гель-электрофореза 41
3.2 Анализ транскриптов, кодируемых геном SGMS1, с помощью секвенирования RNA CaptureSeq 42
3.2.1 Дизайн зондов 42
3.2.2 Технология RNA CaptureSeq 3.3 Обработка суммарной РНК с помощью РНКазы R 45
3.4 Синтез одноцепочечной кДНК 45
3.5 ОТ-ПЦР и секвенирование продуктов ПЦР 3.5.1 ОТ-ПЦР 45
3.5.2 Электрофорез продуктов ПЦР 46
3.5.3 Секвенирование по Сенгеру 46
3.6 Нозерн-блот анализ 49
3.6.1 Электрофорез в денатурирующем агарозном геле и капиллярный перенос РНК на мембрану 49
3.6.2 Электрофорез в денатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ) и электроперенос РНК на мембрану 49
3.6.3 Получение (-32P)dATP-меченых зондов 50
3.6.4 Гибридизация зондов с РНК на мембране 51
3.7 ОТ-ПЦР в реальном времени 52
3.7.1 Анализ данных ОТ-ПЦР в реальном времени и статистика 55
3.8 Выделение белка из замороженных тканей 55
3.8.1 Экстракция белка из буфера с сапонином 55
3.9 Метод иммунодетекции 56
3.9.1 Электрофоретическое разделение белка и электроперенос белка на мембрану 56
3.9.2 Гибридизация антител с белками на мембране
3.10 Анализ количества белка SMS1 57
3.11 Биоинформатические методы анализа
3.11.1 Анализ баз данных транскриптома человека 58
3.11.2 Анализ результатов RNA CaptureSeq 58
3.11.3 Анализ результатов секвенирования по Сенгеру 58
3.11.4 Анализ сайтов сплайсинга 59
3.11.5 Поиск промоторов 59
3.11.6 Поиск Alu-повторов и выравнивание их последовательностей 59
3.11.7 Поиск сайтов связывания микроРНК 59
4 Результаты 60
4.1 Исследование экспрессии гена SGMS1 на транскрипционном и трансляционном уровнях в тканях человека 60
4.1.1 Анализ экспрессии мРНК гена SGMS1 60
4.1.2 Количественный анализ полноразмерного белка SMS1 в тканях человека 60
4.1.3 Анализ корреляции между уровнем мРНК гена SGMS1 и уровнем белка SMS1 в тканях человека
4.2 Анализ баз данных транскриптомных исследований гена SGMS1 62
4.3 RNA CaptureSeq-анализ экспрессии гена SGMS1 62
4.4 Анализ несплайсированных интронных РНК 64
4.5 Анализ РНК, подвергающихся альтернативному сплайсингу 68
4.6 Выявление циклических РНК в составе транскриптов гена SGMS1 человека
4.6.1 Анализ баз данных циклических РНК 71
4.6.2 Анализ циклических РНК в образцах РНК лобной коры человека 72
4.7 Анализ представленности циклических РНК в тканях человека 78
4.8 Анализ гомологичных циклических РНК гена Sgms1 у крысы и мыши.. 80
4.9 Анализ гомологичных циклических РНК гена SGMS2 человека 84
4.10 Анализ количественной представленности транскриптов генов сфингомиелинсинтазы 1 в тканях человека, крысы и мыши 87
4.11 Анализ содержания циклических РНК гена SGMS1 в ядерной и цитоплазматической фракциях РНК лобной коры человека 89
4.12 Анализ промоторов, которые могут участвовать в синтезе циклических РНК 90
4.13 Анализ Alu-повторов в структуре гена SGMS1 94
4.14 Анализ последовательностей циклических РНК гена SGMS1 человека на наличие сайтов связывания с микроРНК
5 Обсуждение результатов 98
6 Заключение 108
7 Выводы 110
8 Список основных сокращений 111
9 Список литературы 115
