Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Онкотоксические белки 14
1.1.1. Онкотоксические белки невирусного происхождения 15
1.1.1.1. TRAIL 15
1.1.1.2. MDА7 17
1.1.1.3. HAMLET 19
1.1.2. Онкотоксические белки вирусной природы 23
1.1.2.1. Белок аденовируса E4orf4 23
1.1.2.2. Белок парвовируса NS1 24
1.1.2.3. Белок вируса анемии кур - Апоптин (VP3)
1.1.2.3.1. Структура и характеристика апоптина 27
1.1.2.3.2. Механизмы апоптин-опосредованной клеточной гибели 29
1.1.2.3.3. Фосфорилирование апоптина, как ключевое событие обеспечивающее его противоопухолевый потенциал 32
1.1.2.3.4. Практическое применение апоптина 35
1.2. Клеточная иммунотерапия 37
1.2.1. Терапия с использованием клеток адаптивного иммунитета 37
1.2.1.1. Дендритно-клеточные вакцины 37
1.2.1.2. Т-клеточная терапия
1.3. Современные проблемы иммунотерапии 47
1.4. Заключение 48
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Оборудование 49
2.2. Реактивы 50
2.3. Реагенты, антитела и наборы 51
2.4. Растворы и среды 52
2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 53
2.6. Рестрикция 56
2.7. Лигирование 58
2.8. Приготовление химически компетентных клеток E. coli 59
2.9. Трансформация клеток E.coli 59
2.10 Выделение плазмидной ДНК 60
2.11. Выделение тотальной РНК 61
2.12. Упаковка и очистка лентивирусных частиц 62
2.13. Определение титра лентивирусных частиц 65
2.14. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток 66
2.15. ПААГ-электрофорез и иммуноблоттинг белков 67
2.16. Работа с эукариотическими клетками 69
2.17. Выделение отдельных популяций клеток из периферической венозной крови человека 70
2.18. Активация презентации опухоль-ассоциированного антигена HER2/neu дендритными клетками человека 71
2.19. Определение фенотипического профиля и морфологии зрелых дендритных клеток человека 72
2.20. Проточная цитометрия и подготовка образцов 73
2.21. Праймирование цитотоксических Т-лимфоцитов in vitro и анализ цитотоксического потенциала 74
2.22. Лентивирусная трансдукция активированных ЦТЛ 76
2.23. Исследование эффективности модифицированных Т-лимфоцитов на ксенографтной модели рака молочной железы с использованием иммунодефицитных мышей линии nude 77
2.24. Статистический анализ 78
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Создание рекомбинантной системы межклеточного транспорта онкотоксического белка апоптина на основе лентивирусных векторов 79
3.2. Выбор чувствительной культуры для определения цитотоксического потенциала системы межклеточного транспорта апоптина 87
3.3. Предварительный анализ цитотоксического потенциала межклеточной системы доставки рекомбинантного онкотоксического белка апоптина в культуре клеток in vitro 88
3.4. Поиск способов оптимальной доставки и экспрессии рекомбинантной генетической конструкции, содержащей последовательности сигнальных пептидов и апоптина, в первичной культуре цитотоксических CD8+ Т
3.5. Разработка способа активации модифицированных Т-лимфоцитов in vitro против клеток аденокарциномы молочной железы - MCF7, без снижения уровня экспрессии рекомбинантного апоптина 98
3.6. Исследование цитотоксического потенциала модифицированных Т лимфоцитов человека на модели подкожных ксенографтов на
иммунодефицитных мышах 114
Список литературы
