Введение
Глава I. Обзор литературы 33
1.1 Структурно-функциональная организация хроматина 33
1.1.1 Уровни упаковки эукариотической ДНК 33
1.1.2 30-нм фибрилла 34
1.1.3 Активный хроматин и гистоновый код 39
1.1.4 Создание областей, свободных от нуклеосом, на регуляторных элементах ДНК 41
1.1.5 Декомпактизация хроматина и доступность ДНК 48
1.1.6 Хроматиновые домены в трехмерном пространстве ядра 50
1.2 Коммуникация удаленных регуляторных элементов генома 52
1.2.1 Сближение промоторов и энхансеров: активаторный хроматиновый блок и экспрессионный центр 52
1.2.2 Стабильность промотор-энхансерного взаимодействия: динамический контакт или прочный комплекс? 57
1.2.3 Движущие силы коммуникации в клеточном ядре 61
1.2.4 Свободная диффузия и макромолекулярное скопление 78
1.3 Функциональная компартментализация клеточного ядра 81
1.3.1 Хромосомные территории 84
1.3.2 Ядерный матрикс 87
1.3.3 Ламино- и ядрышко-ассоциированные домены 90
1.3.4 Функциональные ядерные компартменты 1.4 Взаимосвязь между компартментализацией ядра и пространственной организацией хромосом 106
1.5 Заключительные замечания 114
Глава II. Материалы и методы 115
II.1 Работа с клеточным материалом 115
II.1.1 Ведение клеточных культур 115
II.1.2 Индукция эритроидной дифференцировки клеток HD3 115
II.1.3 Выделение эмбриональных эритроидных клеток и фибробластов кур 115
II.1.4 Выделение эмбриональных эритроидных клеток и клеток мозга мыши 116
II.1.5 Получение Ter119+ и Ter119– клеток мыши 116
II.1.6 Окрашивание клеток бензидином для выявления гемоглобина 117
II.2 Работа с ДНК и РНК 117
II.2.1 Выделение геномной ДНК из эукариотических клеток 117
II.2.2 Выделение бакмидной ДНК из клеток E. сoli 118 II.
2.3 Приготовление эквимолярной смеси продуктов лигирования на основе бакмиды 119
II.2.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле 119
II.2.5 Выделение тотальной РНК из эукариотических клеток 120
II.2.6 Обратная транскрипция-ПЦР 121
II.2.7 Флуорометрическое измерение концентрации нуклеиновых кислот 122
II.3 Полимеразная цепная реакция 122
II.3.1 Простая жидкостная ПЦР 122
II.3.2 ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробами
II.4 Клонирование 123
II.5 3С-анализ
II.5.1 Фиксация клеток и изоляция ядер 123
II.5.2 Рестрикция и лигирование ДНК 124
II.5.3 Очистка продуктов лигирования 125
II.5.4 Количественный анализ продуктов лигирования 125
II.6 M3C-анализ 127
II.6.1 Выделение нуклеоидов 127
II.6.2 Получение ядерных матриксов и лигирование ямДНК 128
II.6.3 Количественный анализ продуктов лигирования 129
II.7 INGRID-анализ 130
II.7.1 Получение сшитых фрагментов хроматина 130
II.7.2 ПЦР в геле 131
II.8 4C-анализ 133
II.8.1 Фиксация клеток, первичная рестрикция и лигирование 133
II.8.2 Вторичная рестрикция, лигирование и третичная рестрикция 134
II.8.3 Амплификация продуктов лигирования 134
II.8.4 Подготовка 4С-библиотек для секвенирования 135
II.8.5 Биоинформатический анализ 4C-данных 1 II.9 ChIP-seq 138
II.10 Иммуноцитохимия 139
II.11 Флуоресцентная гибридизация in situ 141
II.12 Электронная микроскопия 142
II.13 Иммуноблотинг белков и окрашивание Кумасcи 142
II.14 Программное обеспечение 143
II.15 Последовательности праймеров и флуоресцентных проб для ПЦР 144
Глава III. Результаты 155
III.1 Структура индивидуальных активаторных хроматиновых блоков 155
III.1.1 Активаторный хроматиновый блок домена бета-глобиновых генов кур 155
III.1.2 Объединенный активаторный хроматиновый блок альфа-глобиновых генов и гена TMEM8 166
III.2 Механизмы контактов удаленных регуляторных элементов генома 173
III.2.1 Переосмысление процедуры 3С: лигирование в ядре, а не в растворе 173
III.2.2 Абсолютные частоты лигирования в процедуре 3С 193
III.2.3 Количественный анализ взаимодействия удаленных элементов генома с помощью метода молекулярных колоний 201
III.2.4 Изучение роли ядерного матрикса в поддержании контактов удаленных элементов генома 228
III.3 Механизмы поддержания трехмерной организации генома 241
III.3.1 Полногеномный анализ пространственных взаимодействий СpG-островков,
содержащих промоторы генов домашнего хозяйства 241
Глава IV. Обсуждение результатов 265
IV.1 Пространственная организация домена бета-глобиновых генов кур в эритроидных клетках на разных стадиях эмбрионального развития 265
IV.2 Регуляция транскрипции альфа-глобиновых генов и гена TMEM8 посредством сборки альтернативных активаторных хроматиновых блоков 271
IV.3 Пересмотр ключевых этапов техники фиксации конформации хромосомы и предложение новой модели позиционирования геномных элементов в ядре 274
IV.4 Абсолютные частоты лигирования в процедуре 3С 284
IV.5 Выявление прямых контактов между геномными элементами методом молекулярных колоний 287
IV.6 Ядерный матрикс как платформа для взаимодействия удаленных регуляторных элементов генома 291
IV.7 Кластеризация CрG-островков как важный фактор пространственной организации интерфазных хромосом 298
Заключение 303
Выводы 307
Список литературы
