Введение
Список использованных сокращений и терминов 5
1 Введение 6
1.1 Актуальность работы 6
1.2 Цель и задачи исследования 8
1.3 Научная новизна и практическая значимость работы 9
1.4 Положения, выносимые на защиту 10
1.5 Степень достоверности и апробация результатов 10
2 Обзор литературы 12
2.1 Векторные конструкции, используемые для получения клеточных линий, экспрессирующих целевые белки 13
2.2 Промоторы и энхансеры, используемые для получения клеточных линий-продуцентов целевых белков 17
2.3 Перспективы использования инсуляторов для повышения эффективности экспрессии целевого гена в клеточных линиях-продуцентах 20
2.4 Повышение уровня экспрессии трансгена с помощью А/Т-богатых последовательностей, ассоциированных с белками ядерного матрикса (S/MAR) 28
2.5 Повышение уровня экспрессии трансгена в культурах клеток с помощью регуляторных элементов, содержащих сильные промоторы генов «домашнего хозяйства» 32
2.6 Повышение уровня экспрессии трансгена в культурах клеток с помощью регуляторных элементов, защищающих от НР1-зависимой репрессии 35
3 Материалы и методы 37
3.1 Объекты 37
3.2 Общие методы работы с бактериями Escherichia coli
3.2.1 Приготовление музея штамма 37
3.2.2 Приготовление компетентных клеток 37
3.2.3 Трансформация компетентных клеток E.coli DH5 38
3.3 Методы работы с ДНК 38
3.3.1 Выделение плазмидной ДНК в большом объеме (Maxiprep) 38
3.3.2 Выделение плазмидной ДНК в маленьком объеме (Miniprep) 39
3.4 Методы генетической инженерии 40
3.4.1 Горизонтальный гель-электрофорез ДНК и выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
3.4.2 Переосаждение ДНК из раствора 41
3.4.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 41
3.4.4 Создание трансгенных конструкций 41
3.5 Работа с культурой клеток S2 43
3.5.1 Ведение культуры клеток S2 43
3.5.2 Трансфекция культуры клеток S2 43
3.6 Работа с культурой клеток СНО-К1 44
3.6.1 Ведение культуры клеток СНО-К1 44
3.6.2 Получение трансфецированных клеточных линий CHO-K1 44
3.6.3 Поддержание пулов трансфецированных клеток 45
3.6.4 Получение индивидуальных клонов 45
3.7 Определение уровня экспрессии репортерных генов 46
3.7.1 Двойной люциферазный анализ 46
3.7.2 Выделение ДНК, РНК, обратная транскрипция 46
3.7.3 Количественная ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени 46
3.7.4 Цитофлуориметрический анализ клеток СНО-К1 47
4 Результаты и обсуждение 48
4.1 Создание модельной системы для тестирования терминаторов на повышение стабильности и уровня экспрессии репортерного гена в CHO-клетках 48
4.2 Исследование стабильности и эффективности экспрессии EGFP в тотальной популяции трансфецированных клеток 50
4.3 Исследование стабильности и эффективности экспрессии EGFP в стабильных клеточных линиях полученных после 30 дней трансфекции 52
4.4 Исследование стабильности и эффективности экспрессии EGFP в стабильных клеточных линиях полученных после 90 дней трансфекции 54
4.5 Активность энхансера мобильного элемента copia зависит от выбранной клеточной линии дрозофилы 57
4.6 Активность энхансера не зависит от количества copia-элементов, которые содержатся в клеточной линии 60
4.7 Энхансер copia индуцирует транскрипцию в двух направлениях с эффективностью, сравнимой с базовой активностью hsp70-промотора 62
4.8 Инсулятор из ретротранспозона МДГ4 незначительно влияет на активность энхансера copia в положении перед промотором. 63
4.9 Две копии инсулятора, окружающие энхансер, полностью инактивируют его активность. 66
4.10 Транскрипция с энхансера не влияет на активность инсулятора МДГ4. 70
5 Выводы 73
6 Благодарности 74
7 Список литературы 75
