Введение
2. Обзор литературы 6
2.1. Флуоресцентное мечение белков 6
2.1.1. Генетически кодируемые метки 6
2.1.1.1. Пептиды 6
Тетрацистеиновая последовательность 6
Олигогистидиновая последовательность 7
Flag tag 7
Ферментативная модификация пептидов 8
2.1.1.2. Белки 10
Флуоресцентные белки 10
Самомодифицирующиеся белки 11
Флуорофор-связывающие белки 13
Флуороген-активирующие белки 14
2.1.1.3. Неприродные аминокислоты 17
2.1.2. Химические метки 19
2.1.2.1. Неспецифическое мечение 19
2.1.2.2. Специфическое мечение 19
2.2. Методы молекулярной эволюции белков 22
2.2.1. Случайный мутагенез 22
2.2.2. Сайт-специфический мутагенез 24
2.2.3. In vitro рекомбинация 27
2.3. Моделирование в биологии 30
2.3.1. Модельные соединения 30
2.3.2. Компьютерное моделирование
2.3.2.1. Определение позиций для мутагенеза 34
2.3.2.2. Выбор перспективных замен 37
2.3.2.3. In vitro рекомбинация 38
2.3.2.4. Дизайн белков 38
Редизайн 38
De novo дизайн 39
3. Материалы и методы 42
3.1. Амплификация фрагментов днк 42
3.2. Электрофорез в агарозном геле 42
3.3. Очистка днк 43
3.4. Сайт-специфический мутагенез
3.4.1. Гибридизация N- и C- концевых фрагментов 43
3.4.2. Самособирающееся клонирование 44
3.4.3. “Аква” клонирование
3.5. Создание библиотек случайных мутантов 45
3.6. Трансформация бактерий
3.6.1. Химическая трансформация 46
3.6.2. Электрическая трансформация
3.7. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 46
3.8. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле 47
3.9. Определение спектральных свойств 48
3.10. Ph-титрование 48
3.11. Определение констант диссоциации 48
3.12. Получение генетических конструкций
3.12.1. Клонирование гена blc 50
3.12.2. Создание конструкций для временной трансфекции культур эукариотических клеток... 3.13. Культивирование и временная трансфекция культур эукариотических клеток 51
3.14. Флуоресцентная микроскопия 51
3.15. Компьютерное моделирование 3.15.1. modeller 53
3.15.2. AutoDoc Vina 53
3.15.3. Rosetta 53
4. Результаты и обсуждение 56
4.1. Разработка и изучение новых спектральных вариантов флуоресцентных белков, содержащих триптофан в составе хромофора 56
4.1.1. Получение оранжевых триптофановых флуоресцентных белков 56
4.1.2. Изучение роли замен 58
4.1.3. Возможные структуры хромофора 61
4.1.4. Поведение при денатурации 64
4.1.5. рН титрование 66
4.1.6. Фотоконверсия 69
4.1.7. Модельное соединение 70
4.1.8. Компьютерное моделирование 73
4.2. Разработка и изучение флуоресцентных меток на основе флуороген активирующих белков 76
4.2.1. Выбор флуорогенов 76
4.2.2. Поиск флуороген-активирующих белков
4.2.2.1. In silico скрининг 81
4.2.2.2. Клонирование генов белков 3HO2, 1DOS, 1PVS и 2QRY 83
4.2.2.3. Характеристика найденных белков 83
4.2.2.4. Анализ причин различий в флуорогенности 87
4.2.3. Создание флуороген-активирующих белков 90
4.2.3.1. Выбор белка для моделирования 90
4.2.3.2. In silico мутагенез липокалина 91
4.2.3.3. In vitro анализ библиотеки мутантов 92
4.2.3.4. Характеристика выбранных пар белок-флуороген 92
4.2.3.5. Изучение роли замен 96
4.2.3.6. Использование мутантов липокалина в качестве метки для флуоресцентной микроскопии 98
4.2.4. Улучшение созданных белков 105
4.2.4.1. Случайный мутагенез 105
4.2.4.2. Характеристика белков, полученных случайным мутагенезом 105
4.2.4.3. In silico мутагенез 107
4.2.4.4. Характеристика белков, полученных в результате in silico мутагенеза 108
4.2.4.5. Использование улучшенных вариантов в качестве метки для флуоресцентной микроскопии 111
4.2.5. Дальнекрасные флуорогены 113
5. Заключение 116
6. Выводы 117
7. Список сокращений 118
8. Список литературы 120
