Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Сигнальные пути Wnt 9
2.1.1. Лиганды Wnt-сигнализации и их липидирование 11
2.1.2. Wnt-фенотипы, функциональная избыточность и специфичность 12
2.1.3. G-белки в Wnt-сигналинге 13
2.1.4. Сигнализация через систему рецепторного комплекса Frizzled-LRP 16
2.1.5. Рецепторы Wnt, неродственные Frizzled 20
2.2. Регуляция активности Wnt-сигнальных путей 24
2.2.1. Секретируемые ингибиторы Wnt 24
2.2.1.1. Семейство белков Dickkopf (Dkk) 24
2.2.1.2. Семейство белков sFRP 29
2.2.1.3. WIF-1 33
2.2.1.4. Wise и SOST 33
2.2.1.5. Cerberus 35
2.2.1.6. IGFBP-4 35
2.2.2. Трансмембранные ингибиторы Wnt 36
2.2.2.1. Семейство белков Shisa 36
2.2.2.2. Waif1/5T4 37
2.2.2.4. Tiki1 38
2.2.3. Активаторы Wnt-сигнальных каскадов 38
2.2.3.1. Семейство белков R-Spondin 38
2.2.3.2. Фактор Norrin 40
2.3. Механизмы распределения белков Wnt в тканях 42
2.3.1. Свободная диффузия, белки-переносчики и везикулярный транспорт 43
2.3.2. Цитонемный транспорт белков Wnt 45
2.3.3. Wnt-цитонемы в эмбриональном развитии 46
2.4. Семейство факторов Noggin 48
2.4.1. Структура белка Noggin 48
2.4.2. Белок Noggin человека 49
2.4.3. Структурные основы ингибиторной функции Noggin 50
2.4.4. Экспрессия, активация и функциональный цикл Noggin 51 2.4.5. Экспрессия Noggin в эктодермальных производных 51
2.4.6. Экспрессия Noggin в мезодермальных производных 52
2.4.7. Биологическая функция 52
2.4.8. Разнообразие факторов Noggin и их номенклатура 53
2.4.9. Белок Noggin4 54
Приложение 1 56
3. Результаты и обсуждение 69
3.1. Результаты 69
3.1.1. Описание распределения экспрессии Noggin4 в раннем развитии G. gallus 69
3.1.2. Исследование влияния Noggin4 на развитие осевых и головных структур 71
3.1.3. Оценка влияния Noggin4 на активность специфических люциферазных репортеров 72
3.1.4. Изучение способности Noggin4 связывать лиганды разных сигнальных путей 74
3.1.5. Изучение влияния Noggin4 на экспрессию генов-мишеней Wnt/-catenin пути 75
3.1.6. Проверка специфичности и физиологической эффективности MO 75
3.1.7. Свидетельства нелокальности физиологического действия Noggin4 76
3.1.8. Оценка способности Noggin4 к диффузии в межклеточном пространстве in vivo 77
3.2. Обсуждение 80
3.2.1. Noggin4 консервативно экспрессируется в гомологичных эмбриональных структурах у амфибий и птиц 80
3.2.2. Noggin4 не влияет на активность BMP и Nodal/Activin 80
3.2.3. Noggin4 связывает белок Wnt8 и подавляет активность каскада Wnt/-catenin 81
3.2.4. Noggin4 действует нелокально, быстро распространяясь в межклеточном пространстве in vivo 82
3.2.5. Noggin4 регулирует передне-задний градиент сигнальной активности Wnt8 84
Приложение 2 86
4. Выводы 103
5. Материалы и методы 104
5.1. Материалы 104
5.1.1. Реактивы 104
5.1.2. Ферментные препараты 104
5.1.3. Лабораторное оборудование 105
5.1.4. Лабораторные животные 105
5.1.5. Буферы и растворы 105
5.1.6. Микробиологические среды 107
5.1.7. Предоставленные штаммы 107
5.1.8. Предоставленные плазмиды 107
5.2. Методы 108
5.2.1. Амплификация ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) 108
5.2.2. Электрофорез в агарозном геле 108
5.2.3. Элюция ДНК из агарозного геля 108
5.2.4. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 108
5.2.5. Достройка 3 -конца двуцепочечных молекул ДНК 109
5.2.6. Отщепление выступающего 3 -конца двуцепочечных молекул ДНК 109
5.2.7. Лигирование молекул ДНК 109
5.2.8. Трансформация клеток Escherichia coli 109
5.2.9. Выделение плазмидной ДНК из бактерий Escherichia coli
5.2.10. Изготовление ДНК конструкций 110
5.2.11. Транскрипция in vitro 114
5.2.12. Получение зародышей X. laevis и G. gallus 114
5.2.13. Синтез белков в зародышах Xenopus laevis 115
5.2.14. Электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях в ПААГ 115
5.2.15. Выделение секретируемых белков из межклеточного пространства эмбриональной ткани 115
5.2.16. Измерение внутриклеточной концентрации активного P-Smad1 116
5.2.17. Оценка уровней экспрессии Noggin4 и EGFP-Noggin4 117
5.2.18. Количественная ко-иммунопреципитация 118
5.2.19. Иммуноблот (Western Blotting) 118
5.2.20. Блокирование трансляции эндогенных мРНК при помощи морфолино 119
5.2.21. Фиксация зародышей Xenopus laevis 120
5.2.22. Фиксация зародышей Gallus gallus 121
5.2.23. Гибридизация in situ тотальных препаратов зародышей X. laevis и G. gallus 121
5.2.24. Синтез dig-меченной анти-мРНК для гибридизации in situ 122
5.2.25. Экстракция тотальной РНК из зародышей шпорцевой лягушки 123
5.2.26. Экстракция тотальной РНК из куриных зародышей 123
5.2.27. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция. 124
5.2.28. Определение параметров подвижности белков по FRAP 125
5.2.29. Измерение люциферазной активности специфических репортеров. 126
5.2.30. Калибровка конфокального микроскопа 126
5.2.31. Конфокальная микроскопия и эксперименты FRAP
7. Список сокращений 129
Список литературы
