Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Молекулярная биология вируса гепатита В 11
1.1.1 Организация генома 12
1.1.2 Вирусные белки 14
1.1.3 Жизненный цикл ВГВ 17
1.1.4 Репликация ВГВ 19
1.1.5 Серологические маркеры ВГВ-инфекции 21
1.2 Молекулярные варианты ВГВ 23
1.2.1 Генотипы и серотипы ВГВ 24
1.2.2 Мутанты S гена 28
1.2.3 Мутанты preCore и Сore гена 30
1.2.4 Мутанты X гена 32
1.2.5 Мутации устойчивости к аналогам
32 нуклеозидов/нуклеотидов .
1.3 Диагностика ВГВ 37
1.4 Профилактика гепатита В 39
2 Материалы и методы 41
2.1 Пациенты 41
2.2 Серологические маркеры и клинические показатели 41
2.3 Выделение ДНК ВГВ и ПЦР 41
2.4 Секвенирование фрагмента гена полимеразы для определения мутаций устойчивости к АН
2.4.1 Амплификация участков генома ВГВ 42
2.4.2 Анализ и очистка продуктов ПЦР 42
2.4.3 Секвенирующая ПЦР 43
2.4.4 Очистка продуктов секвенирующей ПЦР 43
2.4.5 Анализ продуктов реакции секвенирования 44
2.4.6 Обработка секвенированных последовательностей
2.5 Определение мутаций устойчивости к аналогам нуклеозидов методом ПЦР в реальном времени в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green
2.5.1 Постановка ПЦР и расчет эффективности ПЦР 45
2.5.2 Клонирование ПЦР-продуктов в вектор pUC18 46
2.5.3 Получение культуры компетентных бактериальных клеток E.coli
2.5.4 Трансформация культуры бактериальных клеток плазмидной ДНК .
2.5.5 Щелочное выделение плазмидной ДНК 47
2.5.6 Рестрикционный анализ плазмидной ДНК 48
2.5.7 Секвенирование ДНК 48
2.6 Определение нуклеотидной последовательности геномов ВГВ методом NGS секвенирования
2.6.1 Амплификация полных геномов ВГВ
2.6.2 Анализ и очистка продуктов ПЦР
2.6.3 Секвенирование ДНК ВГВ .
2.6.4 Обработка секвенированных последовательностей .
2.6.5 Построение филогенетических деревьев
2.7 Статистический анализ
Результаты собственных исследований и их обсуждение
3.1 Определение генотипа ВГВ и уровня вирусной нагрузки у 3.2
пациентов с ХГВ в Северо-Западном регионе РФ Выявление мутантных форм ВГВ
3.2.1 Определение мутаций в гене полимеразы ВГВ, определяющих устойчивость к АН, методом прямого секвенирования
3.2.2 Выявление мутаций, приводящих к изменениям YMDD-мотива ВГВ, методом ПЦР в реальном времени
3.2.3 NGS секвенирование геномов ВГВ
3.2.4 Мутации S гена
3.2.5 Мутации preCore/Core и X генов Заключение
Выводы
Список сокращений и условных обозначений
Список литературы
