Введение
Обзор литературы 11
1. Мультифункциональный белок YB-1 11
1.1 Краткая история открытия Y-бокс-связывающих белков 11
1.2 Структурно-функциональная организация белка YB-1 12
1.3 Обзор функций YB-1 в организме 15
1.4 Функции YB-1 в цитоплазме
1.4.1 Упаковка мРНК и её стабилизация 16
1.4.2 Регуляция трансляции 19
1.4.3 Участие в формировании цитоплазматических гранул 23
1.5 Функции YB-1 в ядре 25
1.5.1 Транскрипция 25
1.5.2 Репарация ДНК 31
1.5.3 Сплайсинг пре-мРНК 1.6 Секреция YB-1 и функции внеклеточного белка 34
1.7 Регуляция ядерно-цитоплазматического распределения YB-1 36
1.8 Роль YB-1 в онкологических заболеваниях человека 1.8.1 YB-1 как прогностический маркер при онкологических заболеваниях 39
1.8.2 YB-1 как фактор лекарственной устойчивости раковых клеток 41
1.8.3 YB-1 в развитии онкологических заболеваний 42
2. Химиотерапия в лечении онкологических заболеваний 46
2.1 Доксорубицин 47
2.2 Этопозид 49
Материалы и методы 52
1. Генетические конструкции 52
2. Получение компетентных клеток Escherichia coli 55
3. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК 55
4. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli 55
5. Минипрепаративное выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli 56
6. Обработка плазмид эндонуклеазами рестрикции 57
7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 57
8. Лигирование ДНК 58
9. Электрофорез ДНК в агарозном геле 10. Получение радиоактивно меченной ДНК 58
11. Обработка ДНК доксорубицином 59
12. Анализ изменения подвижности ДНК-белковых комплексов в геле (гель-шифт) 59
13. Связывание на фильтрах 60
14. Выделение рекомбинантного YB-1 и его мутантных форм из E. coli 60
15. Выделение белков GST и GST-NLS 61
16. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии SDS 62
17. Иммунологический анализ препаратов белков (иммуноблоттинг) 62
18. Расщепление YB-1 20S протеасомой in vitro 63
19. Коиммунопреципитация YB-1 и 20S протеасомы 63
20. Масс-спектральный анализ продуктов расщепления YB-1 20S протеасомой 64
21. Поддержание клеточных культур 64
22. Трансфекция клеток генетическими конструкциями 65
23. Получение NIH3T3, стабильно синтезирующих HA-YB-1 (WT) и HA-YB-1 (1–219) 65
24. Получение клеточных, цитоплазматических и ядерных экстрактов 66
25. Иммунофлуоресцентная микроскопия 67 26. Построение кривых роста клеточных линий 67
27. Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла 68
28. Тест на клоногенность 68
29. Обработка клеток доксорубицином 68
30. Анализ транскриптома 69
31. Пул-даун YB-1 с компонентами репарационных комплексов 34. Модельная система для изучения ядерного импорта белков in vitro 70
35. Получение цитоплазматического экстракта клеток HeLa для модельной системы ядерного импорта белков in vitro 71
Результаты 72
1. Определение места связывания YB-1 с 20S протеасомой 72
2. Расщепление YB-1 20S протеасомой происходит в соответствии с моделью шпильки 74
3. В молекуле YB-1 есть два альтернативных сайта расщепления 20S протеасомой 75
4. Укороченная форма белка YB-1 не влияет на пролиферацию клеток, но защищает их от повреждающего действия доксорубицина 78
5. Устойчивые к расщеплению 20S протеасомой формы YB-1 не защищают клетки от действия доксорубицина 82
6. Укорочения YB-1 под действием 20S протеасомы достаточно для его перехода в ядро 83
7. Укороченный и полноразмерный YB-1 по-разному изменяют профиль экспрессии генов 85
8. Укороченный белок YB-1 входит в состав ДНК-репарационных белковых комплексов 88
Обсуждение результатов и заключение 91
Выводы 96
Список литературы
