Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1.Бактериальные фитохромы 13
1.1.1 Классификация фитохромов 13
1.1.2. Доменная организация фитохромов 14
1.1.3. Структура бактериальных фитохромов 17
1.1.4 Фотосостояния бактериальных фитохромов: формы Pr, Pfr, Pnr 20
1.1.5. Узел полипептидной цепи – уникальный структурный элемент бактериальных фитохромов 23
1.1.5.1 Типы узлов в структуре различных белков 23
1.1.5.2 Функции узлов в белках 27
1.1.5.3 Фолдинг белков с узелковыми структурными элементами
1.2. Хромофоры бактериальных фитохромов 31
1.3. Флуоресцентные маркеры на основе бактериальных фитохромов 32
1.3.1 Разработка флуоресцентных маркеров 32
1.3.1.1. Биомаркеры серии IFP 32
1.3.1.2 Биомаркеры серии iRFP 33
1.3.1.3 Белок iSplit 34
1.3.1.4. Фотоактивируемые ближне-инфракрасные флуоресцентные белки 35
1.3.2 Использование флуоресцентных маркеров на основе бактериальных фитохромов для прижизненной визуализации клеточных процессов 36
1.3.3 Использование ближне-инфракрасные флуоресцентные белки в передовых технологиях получения изображений.. 39
1.3.4 Использование бактериальных фитохромов в оптогенетике 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы 41
2.1. Материалы 41
2.2. Методы 41
2.2.1. Анализ пространственной структуры белков 41
2.2.2. Флуоресцентные измерения 42
2.2.3. Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции 43
2.2.4. Измерение спектров кругового дихроизма 43
2.2.5. Выделение и очистка белков.. 44
2.2.6. Проведение микродиализа 50
2.2.7. Анализ процессов денатурации – ренатурации NIR FPs. 51
2.2.8. Анализ денатурационных зависимостей..
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 53
3.1. Изучение физико-химических и спектральных свойств ближне-инфракрасного флуоресцентного белка iRFP713, полученного на основе бактериального фитохрома, и его отдельных доменов 53
3.2. Изучение спектральных свойств биливердина, его производных и аналогов в растворителях с различной полярностью и вязкостью. Изучение влияния температуры на фотофизические свойства биливердина 67
3.3. Определение параметров равновесного связывания ближне-инфракрасного флуоресцентного белка на основе бактериального фитохрома с биливердином 73
3.4. Изучение кинетики взаимодействия флуоресцентного белка на основе бактериального фитохрома с биливердином и изменения структуры его холоформы при изменении внешних условий (например, кислотности, ионов металлов, окислительно-восстановительного потенциала) 76
3.5. Ковалентное и нековалентное связывание BV с мутантными формами iRFP713, iRFP682 и iRFP670 80
3.6. Структура и собственная УФ-флуоресценция NIR FPs и их мутантных вариантов с различным содержанием и локализацией цистеиновых остатков. 82
3.7. Спектральные свойства NIR FPs и их мутантных вариантов с различным содержанием и локализацией цистеиновых остатков. 89
3.8. Структура хромофора, ковалентно связанного с остатком Cys256 в GAF домене BphPs. 96
3.9. Стабильность NIR FPs и их мутантных форм 3.10. Процессы денатурации–ренатурации NIR FPs и их мутантных форм 106
3.11. Влияние краудинг-агентов на структуру и процессы денатурации флуоресцентных белков на основе бактериальных фитохромов 114
Выводы 118
Список литературы
