Введение
ГЛАВА1. Обзор литературы 13
1.1. Характеристика одноцепочечных антител 13
1.1.1. Структура одноцепочечных антител 13
1.1.2. Практическое применение одноцепочечных антител 16
1.1.3. Разработка VHH антител для терапии опухолей 18
1.2. Рецептор CD47 и его место в развитии раковых заболеваний 22
1.2.1. Структура CD47 24
1.2.2. Взаимодействие CD47 с лигандами
1.2.2.1. Взаимодействие CD47 с SIRPa 26
1.2.2.2. Взаимодействие CD47 с TSP-1 30
1.2.2.3. Взаимодействие CD47 с интегринами
1.2.3. Роль CD47 на эритроцитах 32
1.2.4. CD47 и апоптоз 33
1.2.5. Терапевтические возможности блокирования CD47 38
1.3. Методы получения рекомбинантных антител 42
1.3.1. Особенности метода фагового дисплея 46
1.3.2. Особенности технологии рибосомного дисплея 50
ГЛАВА 2. Материалы и методы 52
2.1. Основные реактивы и ферментные препараты 52
2.2. Используемые клеточные линии и антитела з
2.3. Используемые буферные растворы и среды 55
2.4. Буферы для выделения плазмид 56
2.5. Иммунизация животного 57
2.6. Выделение PBMC из крови методом экстракции в градиенте фиколла 58
2.7. Методы работы с РНК 2.7.1. Выделение РНК из PBMC методом тризольной экстракции 58
2.7.2. Синтез кДНК 59
2.8. Методы работы с ДНК 60
2.8.1. ПЦР с праймерами, специфичными к VH-VL и VHH участкам 60
2.8.2. Гнездовая ПЦР для наработки препаративного количества фрагмента 61
2.8.3. Электорофоретическое разделение фрагментов ДНК 62
2.8.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 63
2.8.5. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции 63
2.8.6. Лигирование последовательностей антител в фагмидный вектор63
2.8.7. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК 64
2.8.8. Секвенирование плазмид 66
2.9. Методы работы с бактериями E.coli 66
2.9.1. Получение компетентных клеток 66
2.9.2. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК 2.10. Рестрикционный анализ отобранных VHH 68
2.11. Методы работы с фагами
2.11.1. Подготовка клеток и бактериофага 68
2.11.2. Приготовление фаговой библиотеки 69
2.11.3. Паннинг 71
2.11.4. Наращивание фага для следующего раунда паннинга 73
2.12. Методы работы с белками 74
2.12.1. Экспрессия рекомбининтных VHH в аналитическом и препаративном вариантах 74
2.12.2. Лизис клеток и очистка белка 74
2.12.3. Электрофоретический анализ белков 75
2.12.4. Вестерн-блот анализ белков 75
2.12.5. Измерение концентрации белков
2.13. Иммуноферментный анализ 76
2.14. Методы работы с эукариотическими клетками
2.14.1. Культуры клеток, использованные в работе 76
2.14.2. Замораживание клеток 77
2.14.3. Размораживание клеток 77
2.14.4. Ведение культуры прикрепленных клеток 78
2.14.5. Ведение суспензионных клеточных культур 78
2.14.6. Ведение гибридомы для наработки моноклонального антитела B6H12.2 79
2.14.7. Оценка жизнеспособности клеток
2.15. Тестирование на апоптоз 79
2.16. Тестирование на фагоцитоз 80
2.16.1. Выделение моноцитарной фракции из PBMC 80
2.17. Тест на мышиной модели ксенографта опухоли 81
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 82
3.1. Получение фаг-дисплейной библиотеки вариабельных фрагментов тяжелой цепи иммуноглобулина альпаки 82
3.2. Дизайн праймеров 82
3.3. Модификация фагмиды pHEN2 patent для клонирования последовательностей VHH 87 3.4. Отбор из полученной библиотеки фрагментов высокоаффинных вариантов VHH к рецептору CD47 и получение рекомбинантных форм этих антител в чистом виде 90
3.5. Препаративное получение VHH антител к CD47 96
3.6. Оценка блокирующей способности антител в конкурентном замещении лиганда SIRPa 98
3.7. Получение биотинилированных VHH антител 99
3.8. Экспрессия и очистка биотинилированных VHH антител 102
3.9. Измерение констант диссоциации VHH методом поверхностного плазмонного резонанса 107
3.10. Тестирование функциональной активности VHH к рецептору CD47 108
3.10.1. Индукция апоптоза 108
3.10.2.Фагоцитоз опухолевых клеток 114
3.11. Исследование влияния антител на мышиной модели ксенографта линии U937 117
Заключение 122
Выводы 123
Благодарности 124
Список литературы
