Введение
1 Введение 8
1.1 Актуальность работы 8
1.2 Цель и задачи исследования 9
1.3 Научная новизна и практическая значимость работы 10
1.4 Положения, выносимые на защиту 11
1.5 Степень достоверности и апробация результатов 12
CLASS 2 Обзор литературы 13
2.1 Особенности регуляции транскрипции у эукариот 13 CLASS
2.1.1 Регуляторные элементы генов, транскрибирующихся РНК-полимеразой II. 14
2.1.1.1 Промоторы 14
2.1.1.2 Энхансеры 16
2.1.1.3 Сайленсеры. 17
2.1.1.4 Области контроля локуса (LCR) 18
2.2 Инсуляторы. 19
2.2.1 Механизмы действия инсуляторов 20
2.2.2 Образование контактов между удаленными участками ДНК 21
2.2.3 Формирование границ топологически ассоциированных доменов (TAD) 23
2.2.4 Примеры инсуляторов дрозофилы
2.2.4.1 Инсуляторы Bithorax-комплекса (BX-C) 27
2.2.4.2 scs- и scs -инсуляторы 30
2.2.4.3 gypsy –инсулятор 31
2.2.4.4 Другие инсуляторы дрозофилы 32
2.3 Известные инсуляторные белки дрозофилы 32
2.3.1 ДНК-связывающие инсуляторные белки дрозофилы 32
2.3.1.1 Исследование ДНК-связывающих инсуляторных белков с помощью метода ChIP-seq 33
2.3.1.2 dCTCF 34
2.3.1.3 Suppressor of Hairy-wing (Su(Hw)) 35
2.3.1.4 GAGA-фактор (GAF) 36
2.3.1.5 Zeste-white 5 (Zw5) 37
2.3.1.6 Boundary element-associated factor of 32kD (BEAF-32) 39
2.3.1.7 Elba-комплекс 40
2.3.1.8 Insensitive (Insv) 41
2.3.1.9 Insulator binding factor (Ibf1 и Ibf2)
2.3.2 Разнообразие ДНК-связывающих инсуляторных белков дрозофилы 42
2.3.3 Белки дрозофилы, ассоциированные с инсуляторами 43
2.3.3.1 Centrosome-associated zinc finger protein 190 (CP190) 43
2.3.3.2 Modifier of mdg4(Mod(mdg4)-67.2) 44
2.3.3.3 Enhancer of yellow 2 (E(y)2) 45
2.4 Домены инсуляторных белков 46
2.4.1 ДНК-связывающие домены белков дрозофилы 46
2.4.1.1 Домен цинковых пальцев C2H2-типа 47
2.4.1.2 BEN-домен 49
2.4.1.3 BED-домен 50
2.4.2 Домены белок-белковых взаимодействий белков дрозофилы 50
2.4.2.1 BTB/POZ-домен 50
2.4.2.2 Zinc finger associated domain (ZAD-домен) 52
2.4.2.3 Структура ZAD-домена 53
2.4.2.4 Димеризация ZAD-домена 55
3 Материалы и методы 57
3.1 Методы работы с бактериями E.coli 57
3.1.1 Использованные штаммы E.coli 57
3.1.2 Использованные плазмиды 57
3.1.3 Получение компетентных клеток 57
3.1.4 Трансформация E. coli 58
3.1.5 Отбор колоний после трансформации бактерий лигазной смесью 58
3.2 Методы работы с ДНК 58
3.2.1 Выделение плазмидной ДНК (Maxiprep) 58
3.2.2 Обработка ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции 59
3.2.3 Лигирование ДНК 59
3.2.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 59
3.2.8 Количественная ПЦР (кПЦР) 61
3.2.11 Горизонтальный гель-электрофорез ДНК 63
3.2.12 Очистка ДНК из геля после электрофореза 63
3.3 Методы работы с РНК 63
3.3.1 РНК-интерференция 63
3.3.2 Выделение РНК из S2-клеток 64
3.3.3 Обратная транскрипция 64
3.4 Методы работы с белками 64
3.4.1 Экспрессия и выделение белков из клеток E.coli 64
3.4.2 Получение ядерного белкового экстракта S2-клеток 65
3.4.3 Выделение ядерного белкового экстракта из эмбрионов 66
3.4.4 Использованные антитела 66
3.4.5 Сшивка белков глутаральдегидом 67 3.4.6 Соосаждение белков на глутатион-сефарозе (GST pull-down) и иммобилизованной амилозе (MBP pull-down) 67
3.4.7 Коиммунопреципитация 67
3.4.8 Электрофорез белков в денатурирующих условиях 68
3.4.9 Окрашивание Coomassie Blue R250 3.4.10 Окрашивание гелей после электрофореза серебром 68
3.4.11 Western blot-гибридизация 69
3.4.12 Метод торможения в геле ДНК-белковых комплексов (EMSA – electrophoretic mobility shift assay) 69
3.5 Дрожжевая двугибридная система 70
3.5.1 Использованный дрожжевой штамм 70
3.5.2 Использованные плазмиды 70
3.5.3 Наращивание дрожжей 70
3.5.4 Трансформация дрожжей 71
3.6 Иммунпреципитация хроматина 72
3.6.1 Фиксация и выделение хроматина из S2-клеток 72
3.6.2 Фиксация и выделение хроматина из куколок. 72
3.6.3 Иммунопреципитация хроматина (ChIP – chromatin immunoprecipitation) 73
3.6.4 Иммунопреципитация хроматина с последующим секвенированием 73
3.7 Методы работы с культурой S2-клеток Drosophila melanogaster 74
3.7.1 Культура S2-клеток Drosophila melanogaster 74
3.7.2 Использованные плазмиды 74
3.7.3 Ведение культуры S2-клеток 74
3.7.4 Трансфекция S2-клеток 74
3.8 Методы работы с линиями мух 75
3.8.1 Использованные линии мух 75
3.8.2 Использованные плазмиды 75
3.8.3 Получение трансгенных линий дрозофил 75
3.8.4 Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в трансгенных линиях 76
3.8.5 Генетические скрещивания 76
3.8.6 Сбор эмбрионов 77
3.9 Методы компьютерной обработки данных 78
3.9.1 Поиск пиков связывания белков с ДНК 78
3.9.2 Визуальная оценка полученных профилей связывания белков с ДНК 78
3.9.3 Анализ колоколизации пиков связывания белков с аннотрированными промоторами и другими геномными участками 78
3.9.4 Поиск мотивов связывания белков с ДНК 78
4 Результаты 79
4.1 Взаимодействие белков Pita и ZIPIC с белком CP190 79
4.2 Поиск доменов белков Pita и ZIPIC, участвующих в белок-белковых взаимодействиях in vitro 82 4.2.1 Доменная структура белков Pita, ZIPIC и CP190 82
4.2.2 Картирование участков белков Pita и ZIPIC, взаимодействующих с белком CP190 83
4.2.3 Димеризация ZAD-доменов белков Pita и ZIPIC 85
4.3 Анализ связывания белков Pita и ZIPIC с ДНК in vivo 86
4.3.1 Полногеномные профили связывания белков Pita и ZIPIC с ДНК 86
4.3.2 Проверка некоторых мест связывания белков Pita и ZIPIC с помощью количественной ПЦР 88
4.4 Белки Pita и ZIPIC способны напрямую связываются с ДНК 91
4.4.1 Поиск специфичных последовательностей ДНК, с которыми связываются белки Pita и ZIPIC 91
4.4.2 Подтверждение прямого связывания белков Pita и ZIPIC со специфичными последовательностями ДНК in vitro 93
4.4.3 Вариабельность сайта связывания белка ZIPIC 94
4.5 Инсуляторная активность сайтов связывания белков Pita и ZIPIC 95
4.5.1 Использование трансгенных линий для изучения инсуляторной активности 95
4.5.2 Энхансер-блокирующая и барьерная активность сайтов связывания белков Pita и ZIPIC 98
4.5.3 Pita вместе с dCTCF участвует в работе Mcp-инсулятора 99
4.5.4 Связывание белка ZIPIC с разными вариантами мотива связывания in vivo 1 5 Обсуждение 103
6 Выводы 107
7 Благодарности 108
8 Список литературы 109
