Введение
Глава 1. Функционирование систем Polycomb/Trithorax 13
1.1. Белки Polycomb группы 13
1.2. Белки Trithorax группы 18
1.3. PRE/TRE-элементы 19
1.4. Роль белок-некодирующей транскрипции 24
1.5. Конкуренция между факторами PcG и TrxG 26
1.6. ДНК-связывающие факторы PRE/TRE 27
Глава 2. GAF – многофункциональный фактор транскрипции D.melanogaster 30
2.1. Структура GAF 30
2.2. Взаимодествие GAF и TrxG 32
2.3 Взаимодействие GAF и PcG 33
Материалы и методы 36
Глава 1. Методы работы с линиями мух 36
1.1. Линии и мутации D. melanogaster, использованные в работе 36
1.2. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и white в трансгенных линиях 36
1.3. Генетические скрещивания 37
1.4. Сбор эмбрионов 37
Глава 2. Методы работы с клетками E.coli 38
2.1. Штаммы E.coli, использованные в работе 38
Глава 3. Методы работы с ДНК 39
3.1. Выделение плазмидной ДНК 39
3.2. Рестрикция и лигирование ДНК 39
3.3. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле 39
3.4. Выделение фрагментов ДНК из геля 40 3.5. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) 40
3.5.1. ПЦР с использованием Taq ДНК-полимеразы 40
3.5.2. ПЦР в реальном времени с использованием Hot-Start Taq-ДНК-полимеразы 40
Глава 4. Методы работы с белками 42
4.1. Очистка белковых комплексов 42
4.2. Электрофорез белков в денатурирующих условиях 42
4.3. Выделение ядерного белкового экстракта из эмбрионов для коиммунопреципитации 43
4.4. Коиммунопреципитация 43
4.5. Вестерн-блот анализ 43
4.6. Получение антител 4.6.1. Экспрессия и очистка антигенов 44
4.6.2. Аффинная очистка антител 44
4.6.3. Посадка белка на сефарозу 44
4.6.4. Аффинная очистка антител из сыворотки 46
4.6.5. Список антител, использованных в работе 46
Глава 5. Иммунопреципитация хроматина 48
Глава 6. Методы работы с дрожжевыми клетками 52
6.1 Дрожжевой штамм, использованный в работе 52
6.2 Плазмиды, использованные в работе 52
6.3 Трансформация дрожжевых клеток 54
Результаты 55
Глава 1. Идентификация белков, являющихся потенциальными факторами группы Polycomb D. melanogaster 55
1.1. Анализ факторов Polycomb/Trithorax выявленных при иммуноаффинной очистке комплекса GAF 55
1.1.1. Ассоциация GAF с белками группы Polycomb 56
1.1.2. Ассоциация GAF с белками группы Trithorax 59
1.2. Выявление прямых партнеров GAF 61
1.2.1. Партнёры GAF, содержащие BTB/POZ домен 61
1.2.2. Партнёры GAF, содержащие цинковые пальцы C2H2-типа 64
1.3. Выявление факторов с ДНК-связывающим доменом цинковые пальцы C2H2 типа, взаимодействующих с dSfmbt, Pho и E(z) белками группы Polycomb 68
Глава 2. Белок CG32767 - новый ДНК-связывающий фактор системы Polycomb
2.1. Получение поликлональных антител к белку CG32767 73
2.2. Белок CG32767 взаимодействует с белком dSfmbt in vivo 74
2.3. Выявление партнёров белка CG32767 в дрожжевой двугибридной системе 75
2.4. Выявление доменов взаимодействия между белками dSfmbt и CG32767 76
2.5. Выявление домена гомодимеризации белка CG32767 79
2.6. Белок CG32767 связывается с PRE-элементами генома D. melanogaster 80
2.7. Белок CG32767 связывается с последовательностью bxdPRE в составе трансгенной конструкции и колокализуется с другими факторами группы PcG 82
2.8. Белок CG32767 взаимодействует с последовательностью bxdPRE вне зависимости от статуса PRE-элемента и проходящей транскрипции 84
Обсуждение 86
Заключение 88
Выводы 90
Благодарности 91
Список литературы 92
