Введение
РАЗДЕЛ 1. Обзор литературы 21
1.1. Горизонтальный перенос генов 21
1.1.1. Основные пути коммуникации бактерий 33
1.1.1.1. Трансформация 40
1.1.1.2. Трансдукция 43
1.1.1.3. Абортивная трансдукция 45
1.1.1.4. Неспецифическая (общая, генерализованная) трансдукция 45
1.1.1.5. Ограниченная (специфическая) трансдукция 45
1.1.1.6. Конъюгация и мобилизация плазмид 46
1.1.1.7. Hsd плазмиды и их репликоны: механизмы распределения плазмид между бактериями
1.2. Места коммуникации бактерий и горизонтальный перенос генов 56
1.3. Факторы, ограничивающие горизонтальный перенос генов 62
1.3.1. Роль систем рестрикции-модификации ДНК в горизонтальном переносе генов среди микроорганизмов 63
1.3.1.1. Основные понятия о системах рестрикции-модификации ДНК 67
1.3.1.2. Классификация и номенклатура ферментов систем рестрикции-модификации 70
1.3.1.3. Системы рестрикции-модификации I типа 73
1.3.1.4. Cистемы рестрикции-модификации III типа 83
1.3.1.5. Cистемы рестрикции-модификации IV типа 84
1.3.1.6. ДНК-метилтрансферазы 86
1.4. Эндонуклеазы рестрикции II типа 102
1.4.1. Обнаружение и первые описания эндонуклеаз рестрикции II типа, классификация и их общие свойства 102
1.4.2. Очистка ферментов систем рестрикции-модификации II типа 103
1.4.3. Клонирование и определение нуклеотидных последовательностей генов систем рестрикции-модификации, получение
штаммов – суперпродуцентов этих ферментов 106
1.4.4. Структурные особенности эндонуклеаз рестрикции типа II и их эволюция 107
1.4.5. Процессы связывания и узнавания ДНК эндонуклеазами типа II 113
1.4.6. Подтипы эндонуклеаз рестрикции типа II 118
1.4.7. Группирование эндонуклеаз рестрикции по структуре каталитического центра 131
1.4.8. Механизм каталитического расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции типа II 137
1.4.9. Молекулярная организация генов систем рестрикции-модификации 143
1.5. Горизонтальный перенос генов систем рестрикции-модификациии скоординированная регуляция экспрессии их отдельных генов 146
1.5.1. Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации I и III типов 150
1.5.2. Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации II типа 152
1.5.3. Роль систем рестрикции–модификации в эволюции бактерий 156
1.5.4. Распространение систем рестрикции-модификации ДНК 161
1.5.5. Локализация генов систем рестрикции-модификации 169
1.5.6. Участие мобильных генетических элементов в переносе генов систем рестрикции-модификации 172
РАЗДЕЛ 2. Материалы и методы исследований 176
2.1. Материалы 176
2.1.1. Штаммы бактерий, бактериофагов и плазмидные вектора 176
2.1.2. Материалы, реактивы и ферменты
1 2.1.2.1. Питательные среды 178
2.1.2.2. Среды и основные буферы 179
2.2. Методы исследования 180
2.2.1. Общие, широко используемые методы 180
2.2.2. Поиск штаммов-продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз 180
2.2.3. Получение бактериальной биомассы 181
2.2.4. Выделение ДНК
2.2.4.1. Выделение плазмидных ДНК 182
2.2.4.2. Выделение ДНК фагов cI857 и 80vir 185
2.2.4.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 185
2.2.4.4. Препаративное выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы 186
2.2.4.5. Препаративное выделение фрагментов ДНК из полиакриламидных гелей 186
2.2.5. Обнаружение и описание систем рестрикции-модификации 187
2.2.5.1. Периодическое культивирование штаммов 187
2.2.5.2. Выделение и очистка обнаруженных сайт-специфических эндонуклеаз 188
2.2.5.3. Определение ферментативной активности сайт-специфических эндонуклеаз 190
2.2.5.4. Реакция метилирования in vivo и in vitro 190
2.2.5.5. Определение типа цитозинового метилирования, осуществляемое МCfrBI 191
2.2.5.6. Тестирование метилтрансферазной активности ферментов 6His-M Eco29kI и 6His-RM Eco29kI 192
2.2.5.7. Определение сайта узнавания и места расщепления фосфодиэфирной связи на субстратной ДНК, обнаруженных сайт-специфических эндонуклеаз 193
2.2.5.8. Определение точки разрезания фосфодиэфирной связи R CfrBI на молекуле субстратной ДНК 194
2.2.5.9. Определение локализации метилированного основания в последовательности сайта CfrBI 195
2.2.5.10. Определение сайта метилирования ДНК-метилтрансферазы M Eco29kI 198
2.2.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 198
2.2.6.1. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pECO29 200
2.2.6.2. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pECL18 200
2.2.6.3. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pKPN2 201
2.2.6.4. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pLG13 202
2.2.6.5. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pZE8 202
2.2.6.6. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей плазмид
2 2.2.7. Транскрипция in vitro 203
2.2.8. Определение активности галактокиназы 204
2.2.9. Измерение концентрации белка 205
2.2.10. Определение молекулярной массы белков в нативных условиях 205
2.2.1. Измерение 3H–меченых препаратов 205
РАЗДЕЛ 3. Результаты исследований и их обсуждение 206
3.1. Поиск сайт-специфических эндонуклеаз и анализ коллекции энтеробактерий, несущих гены систем рестрикции-модификации 206
3.2. Зависимость частоты встречаемости активных генов СРМ от состояния окружающей среды 210
3.3. Взаимное расположение генов систем рестрикции-модификации, сравнительный анализ первичной структуры их основные биохимические свойства и явление изошизрмерии 213
3.4. Конструирование штаммов с повышенным уровнем синтеза отдельных белков систем рестрикции – модификации 218
3.5. Основные биохимические свойства выделенных ферментов 222
3.6. Сравнительный анализ каталитических центров различных эндонуклеаз рестрикции 224
3.7. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов СРМ и их окружения 2 3.7.1. Общая характеристика Hsd плазмид 231
3.7.2. Репликаторы плазмид и их несовместимость 232
3.7.3. Мобилизация hsd плазмид 235
3.7.4. Межплазмидная рекомбинация участвует в эволюции hsd плазмид 236
3.7.5. Модель рекомбинации между мультикопийными плазмидами с участием bom и cer генетических детерминант 237
3.7.6. Рекомбинация между мультикопийными плазмидами с участием bom и cer генетических детерминант 240
3.8. Регуляция экспрессии отдельных генов систем рестрикции-модификации 245
3.8.1. Регуляция экспрессии отдельных генов CfrBI 247
3.9. Пути эволюционного процесса для СРМ типа II 253
3.9.1. Конструирование бифункционального гибридного белка, несущего эндонуклеазную и метилтрансферазную активности Eco29kI 254
3.9.2. Роль N-связывающего домена в эволюционном разнообразии эндонуклеаз рестрикции типа II 258
Заключение 265
Выводы 268
Список сокращений 270
Список литературы 272
