Введение
2. Обзор литературы 16
2.1. Введение: почему мы исследуем гипертермию? 16
2.1.1. Гипертермия и кровеносные сосуды 17
2.1.2. Гипертермия и иммунная система 18
2.1.3. Клеточный ответ на тепловой стресс 20
2.1.4. Гипертермия и сенсибилизация клеток к химио- и радиотерапии 21
2.1.5. Гипертермия в клинической практике 22
2.2. Комплексный характер клеточного ответа на тепловой стресс 25
2.2.1. Биомембраны 26
2.2.2. Цитоскелет 27
2.2.3. Субклеточные компартменты 27
2.3. Тепловой стресс и регуляция экспрессии генов 30
2.3.1. Белки теплового шока (HSPs) 31
2.3.2. Транскрипционные факторы теплового шока (HSFs) 32
2.3.3. Активация транскрипции при тепловом стрессе 36
2.3.4. Репрессия транскрипции при тепловом стрессе 40
2.4. Генотоксические эффекты теплового стресса 45
2.4.1. Система негомологичного соединения концов ДНК (NHEJ) и тепловой стресс 46
2.4.2. Гомологичная рекомбинация (HR) и тепловой стресс 49
2.4.3. Эксцизионная репарация ос но ваний (BER) и тепловой стресс 50
2.4.4. Эксцизионная репарация нуклеотидов (NER) и тепловой стресс 52
2.4.5. Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов (MMR) и тепловой стресс 53
2.4.6. Прямые повреждения ДНК, индуцир уемые тепловым стрессом 54
2.5. Последствия повреждающих эффектов теплового стресса 57
2.5.1. Клеточная смерть, индуцируемая тепловым стрессом 58
2.5.2. Аутофагия и тепловой стресс 59
2.5.3. Арест клеточного цикла и тепловой стресс 60
2.5.4. Преждевременное клеточное с тарение и тепловой стресс 61
3. Материалы и методы 65
3.1. Материалы 65
3.1.1. Клеточные линии 65
3.1.2. Антитела 65
3.1.3. Химические реактивы 66
3.2. Методы 68
3.2.1. Работы с культурами клеток 68
3.2.2. Анализ экспрессии генов 70
3.2.3. Микроскопические исследования 71
3.2.4. Методы анализа повреждений ДНК 74
3.2.5. Методы анализа ДНК-топоизомеразы I (топо1) 75
3.2.6. Другие методики 76
4. Результаты и обсуждение 77
4.1. Введение. Острый тепловой шок - модельная система для изучения клеточного ответа на стресс 77
4.1.1. Характеристика использо ванной в исследовании модели теплового стресса 79
4.1.2. Оптимизация условий строгой синхронизации раковых и нормальных клеток человека 81
4.2. Немедленный ответ клетки на стресс: роль клеточного ядра и эпигенетических факторов 83
4.2.1. Роль вариантного гистона H2AX в немедленном клеточном ответе на тепловой стресс 83
4.2.1.1. Тепловой стресс индуцирует фосфорилирование H2AX в клетках человека 85
4.2.1.2. Паттерн индуцированных тепловым стрессом фокусов H2AX зависит от стадии клеточного цикла 87
4.2.1.3. Тепловой стресс индуцирует образование ДЦР в клетках человека, находящихся на стадиях G1 и G2 клеточного цикла 89
4.2.1.4. Тепловой стресс индуцирует арест либо замедление репликации ДНК 92
4.2.1.5. Индуцированное тепловым стрессом фосфорилирование H2AX происходит при участии разных киназ 94
4.2.1.6. Фосфорилирование H2AX предотвращает коллапс репликативных вилок 96
4.2.2. Динамика ядерных белков в немедленном клеточном ответе на тепловой стресс 99
4.2.2.1. Динамика локализации теломерного белка TRF2 в условиях теплового стресса 100
103
4.2.2.2. Динамика локализации центромерного белка HP1 в условиях теплового стресса 103
Белок HP1 диссоциирует из прицентромерных участков интерфазных хромосом при тепловом стрессе 106
Диссоциация HP1 из прицентромерных участков не связана с деметилированием H3K9 108
Диссоциация HP1 не приводит к декомпактизации центромер 109
4.3. Отложенный ответ клетки на тепловой стресс: последствия комплексного повреждающего действия теплового стресса 112
4.3.1. Молекулярные механизмы индуцированного тепловым стрессом клеточного старения 113
4.3.1.1. Тепловой стресс индуцирует p21-зависимое клеточное старение 113
4.3.1.2. Тепловой стресс индуцирует преждевременное старение только в клетках, находящихся в ранней S-фазе клеточного цикла 116
4.3.1.3. ДНК-топоизомераза I (топо1) является мишенью теплового стресса 120
4.3.1.4. Репликация ДНК необходима для запуска программы клеточного старения,
индуцированного тепловым стрессом и/или камптотецином 125
4.3.1.5. Тепловой стресс и CPT индуцируют персистирующие сигналы о повреждении ДНК в ранне-S-фазных кл етк а х 126
4.3.1.6. Столкновение репликативных вилок с топо1-зависимыми ОЦР приводит к активации персистирующего DDR и последующему преждевременному старению клеток 129
4.3.2. Комплексный характер гиперчувствительности клеток, находящихся в ранней S-фазе
клеточного цикла, к тепловому стрессу 134
4.3.2.1. Тепловой стресс индуцирует частичную ре-репликацию ДНК в клетках, находящихся в
ранней S-фазе клеточного цикла 135
з
4.3.2.2. Обратимость ареста пролиферации, ассоциированного с индуцированным тепловым стрессом клеточным старением 138
4.3.2.3. Тепловой стресс индуцирует амплификацию центросом в клетках, находящихся в ранней S-фазе клеточного цикла 142
4.3.2.4. Нарушение регуляции экспрессии факторов лицензирования репликации ДНК может являться причиной индуцированных тепловом стрессом ре-репликации ДНК и амплификации центросом 143
4.4. Новые подходы к индукции клеточного старения in vitro 146
4.4.1. Модель индукции клеточного старения, сформулированная на основе изучения отложенных эффектов теплового стресса. Использование низкомолекулярных соединений, повреждающих ДНК, для индукции клеточного старения 146
4.4.2. Оптогенетические подходы для индукции клеточного старения in vitro
4.4.2.1. Общая характеристика оптогенетических подходов для индукции преждевременного клеточного старения 150
4.4.2.2. Повреждения ДНК, индуцируемые генетически-кодируемыми фотосенсибилизаторами tKR и miniSOG 152
4.4.2.3. Клеточное старение, индуцированное с помощью генетически кодируемых фотосенсибилизаторов 155
5. Заключение 159
5.1. Динамика и механизмы образования повреждений днк при тепловом стрессе 160
5.2. Фосфорилирование вариантного гистона h2ax в ответе клетки на стресс 165
5.3. Вариабельность клеточного ответа на тепловой стресс, зависящая от стадии клеточного цикла 167
5.4. Клеточное старение, индуцируемое тепловым стрессом и другими повреждающими днк
Агентами 170
Выводы 174
Список литературы 176
Благодарности
