Введение
I. Обзор литературы 12
1.1. Формирование и экспорт мРНП-частиц 12
1.1.1. Состав мРНП-частицы 13
1.1.1.1. Белковые компоненты мРНП-частицы 13
1.1.1.1.1. Открытие первых белков мРНП-частицы: PABP, YBX1 и гяРНП 13
1.1.1.1.2. Белки SR. 14
1.1.1.1.3. Белки связывающие кэп-структуру 15
1.1.1.1.4. Сплайсинг-зависимые белки 16
1.1.1.1.5. Белок NPM1 и полиаденилирование мРНК 17
1.1.1.1.6. Новые белки мРНП-частицы 17
1.1.1.2. мРНК в составе мРНП-частицы 19
1.1.1.2.1. Альтернативные 3 -UTR 19
1.1.1.2.2. Альтернативные 5 UTR 20
1.1.1.2.3. Альтернативный сплайсинг и мРНП-частицы 21
1.1.1.3. Формирование мРНП-частицы 21
1.1.2. Ремоделирование и экспорт мРНП-частицы 24
1.1.2.1. Факторы ремоделинга 24
1.1.2.1.1. THO комплекс 24
1.1.2.1.2. Хеликаза Sub2 28
1.1.2.1.3. TREX-2 комплекс 29
1.1.2.2. Адаптеры 32
1.1.2.2.1. Yra1p 32
1.1.2.2.2. SR-белки, как адаптеры 33
1.1.2.2.3. NAB2 34
1.1.2.3. Рецепторы 35
1.1.2.3.1. Ядерный рецептор Mex67p-Mtr2p 35
1.1.2.3.2. Ядерный рецептор CRM1 -з
1.1.3. Комплекс ядерной поры 37
1.2. Комплекс ORC 40
1.2.1. Структура комплекса ORC 40
1.2.2. Роль ORC-комплекса в репликации 42
1.2.3. Дополнительные функции комплекса ORC
1.2.3.1. Сайленсинге и формирование гетерохроматина 46
1.2.3.2. Связь сестринских хроматид 49
1.2.3.3. Дупликации центросом 51
1.2.3.4. Цитокинез 51
1.2.3.5. Нейрогенез 52
II. Материалы и методы 55
2.1. Материалы, использованные в работе 55
2.1.1. Ферменты 55
2.1.2. Приборы и реактивы 55
2.1.3. Программное обеспечение, базы данных 55
2.1.4. Линии мух 55
2.1.5. Штаммы Escherichia coli и векторы, использованные в работе 2.1.6. Эукариотические клеточные линии и вектора, использованные в работе 56
2.1.7. Праймеры 2.1.7.1. Для создания экспрессионных конструкций в E.coli 56
2.1.7.2. Для секвенирования конструкций 56
2.1.7.3. Праймеры для оценки мРНК генов ras2, ubulin 56D и actin 5C 57
2.1.7.4. Для синтеза дцРНК 57
2.1.7.5. Для оценки количества транскриптов генов Xmas-2, Orc3, Orc4, Orc5, Thoc5, Hpr1, Nxf1 58
2.1.7.6. Для создания экспрессионных конструкций pAc5.1/V5-His B с эпитопами 3хFLAG и HA 58
2.1.7.7. Для синтеза биотинилированных фрагментов мРНК гена ubulin 56D -
2.1.7.8. Для получения ДНК-зонда для флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) 60
2.1.8. Генно-инженерные конструкции 60
2.1.9. Антитела 61
2.2. Методы 63
2.2.1. Работа с нуклеиновыми кислотами 63
2.2.1.1. Работа с ДНК 63
2.2.1.1.1. Приготовление компетентных клеток 63
2.2.1.1.2. Трансформация бактерий 63
2.2.1.1.3. Щелочное выделение плазмидной ДНК 63
2.2.1.1.4. Обработка ферментами рестрикции 64
2.2.1.1.5. Лигирование 64
2.2.1.1.6. Гель-электрофорез ДНК 64
2.2.1.1.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 65
2.2.1.1.8. Клонирование 65
2.2.1.1.9. Секвенирование ДНК 66
2.2.1.2. Работа с РНК 66
2.2.1.2.1 Выделение РНК 66
2.2.1.2.2. Получение библиотеки кДНК 66
2.2.1.2.3. Получение двуцепочечной РНК 67
2.2.1.2.4. Синтез биотинилированных фрагментов мРНК гена ubulin 56D 67
2.2.1.2.5. Метод соосаждения РНК 67
2.2.1.2.6. Транскрипция in vitro 68
2.2.2. Работа с белками 68
2.2.2.1. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 68
2.2.2.2. Получение антител 69
2.2.2.3. Очистка антител 69
2.2.2.4. Выделение ядерного эмбрионального экстракта 69
2.2.2.5. Белковый гель-электрофорез 70
2.2.2.6. Вестерн-блот анализ 70
2.2.2.7. Гель-фильтрация белкового ядерного эмбрионального экстракта -
2.2.2.8. Иммунопреципитация белков из ядерного эмбрионального экстракта 71
2.2.2.9. Иммунопреципитация белков из клеточного лизата 71
2.2.2.10. Иммунопреципитация мРНП 72
2.2.3. Работа с S2 клетками 72
2.2.3.1. РНК-интерференция 72
2.2.3.2. Трансфекция клеточной линии S2 73
2.2.3.3. Иммуноокрашивание S2 клеток 73
2.2.3.4. Гибридизация in situ S2 клеток
2.2.3.4.1. РНК in situ гибридизация с зондом к индивидуальному гену 73
2.2.3.4.2. РНК in situ гибридизация с Cy3-oligo-dT праймером 74
2.2.3.5. Окрашивание S2 клеток EU 75
III. РЕЗУЛЬТАТЫ 76
3.1. Подтверждение взаимодействия комплексов TREX-2 и ORC 76
3.1.1. Получение поликлональных антител к компонентам комплексов TREX-2 и ORC 76
3.1.2. Анализ миграции комплексов TREX-2 и ORC на гель-фильтрационной колонке Superose 6 77
3.1.3. Ко-иммунопреципитация субъединиц комплексов TREX-2 и ORC из ядерного эмбрионального экстракта D. melanogaster 79
3.1.4. Ко-иммунопреципитация субъединиц комплексов TREX-2 и ORC овер-экспрессированных в S2-клетках D. melanogaster 80
3.2. Взаимодействие ORC комплекса с мРНК 81
3.2.1. РНК-иммунопреципитация ORC комплекса 81
3.2.2. Взаимодействие мРНК гена ubulin56D c субъединицами комплексов ORC и TREX-2 82
3.2.3. РНК иммунопреципитация ORC-комплекса при истощении комплексов ORC и TREX2 85
3.3. Взаимодействие ORC-комплекса с белковыми компонентами мРНП-частицы 87
3.3.1. Ко-локализация субъединиц комплекса ORC с комплексом ядерной поры в S2 клетках D. melanogaster - 6 3.
3.2. Взаимодействие ORC-комплекса с белковыми компонентами мРНП-частицы 88
3.3.2.1. Подтверждение взаимодействий ORC-комплекса с белковыми компонентами мРНП-частицы 88
3.3.2.2. Участие ORC-комплекса в ассоциации Nxf1 с мРНК 90
3.3.2.3. Участие белка Hpr1 в ассоциации Nxf1 и ORC с мРНК 91
3.4. Участие ORC-комплекса в экспорте мРНК 93
3.4.1. Участие ORC-комплекса в экспорте мРНК ras-2 93
3.4.2. Участие ORC-комплекса в общем экспорте мРНК 94
3.4.3. Участие ORC-комплекса в общем экспорте новосинтезированной РНК 95
Обсуждение результатов 98
Заключение 107
Выводы 108
Список использованной литературы
