Введение
2. Обзор литературы 14
2.1. Общие сведения о вирусах лейкоза птиц и вызываемых ими заболеваниях .14
2.1.1. История открытия вирусов лейкоза птиц .14
2.1.2. Классификация вирусов лейкоза птиц 14
2.1.3. Морфология, химический состав и структура вирионов 15
2.1.4. Устойчивость к физическим и химическим воздействиям .18
2.1.5. Антигенная активность .18
2.1.6. Эпизоотологические данные .19
2.1.6.1. Восприимчивые виды птиц .19
2.1.6.2. Распространение 20
2.1.6.3. Пути передачи .24
2.1.7. Клинические признаки инфекции и патоморфологические изменения .26
2.1.8. Профилактика заболеваний, вызываемых вирусами лейкоза птиц 28
2.2. Диагностика 30
2.2.1. Обнаружение генома вирусов лейкоза птиц 31
2.2.2. Выделение вирусов лейкоза птиц на культурах клеток
2.2.2.1. Методы выделения ВЛП 31
2.2.2.2. Криоконсервирование клеток ФЭК 32
2.2.3. Обнаружение антигена вирусов лейкоза птиц .34
2.3. Выявление антител к вирусу лейкоза птиц методом иммуноферментного анализа 36
2.3.1. Сущность и принципы метода .37
2.3.2. Непрямой вариант ИФА
2.3.2.1. Носители для сенсибилизации антигена 38
2.3.2.2. Антиген 39
2.3.2.3. Сенсибилизация планшет антигеном 40
2.3.2.4. Конъюгат .41
2.3.2.5. Анализ результатов 41
2.3.3. Преимущества иммуноферментного анализа перед другими методами выявления антител к вирусам лейкоза птиц .44
2.3.4. Выявление антител к вирусу лейкоза птиц с помощью иммуноферментного анализа .44
2.4. Заключение по обзору литературы .47
3. Собственные исследования .49
3.1. Материалы и методы 49
3.1.1. Материалы 49
3.1.2. Оборудование 49
3.1.3. Растворы и химреактивы .51
3.1.4. Методы .52
3.2. Результаты собственных исследований .65
3.2.1. Серологический мониторинг лейкоза птиц, проведённый с 2008 по 2015
гг. в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации 65
3.2.1.1. Исследование сывороток крови кур на наличие типоспецифического антигена p27, проведённое в период 2008-2015 гг 65
3.2.1.2. Исследование сывороток крови кур на антитела к ВЛП-J, проведённое в период 2008-2015 гг 68
3.2.1.3. Выявление вирусов лейкоза птиц на территории Российской Федерации
3.2.2. Выявление генома вирусов лейкоза птиц на территории Российской Федерации с 2008 по 2014 гг 73
3.2.3. Выделение изолятов ВЛП-J из проб патологического материала в первичной культуре клеток ФЭК 74
3.2.4. Выбор изолята для разработки иммуноферментной тест-системы 76
3.2.4.1. Определение титра инфекционной активности выделенных изолятов ВЛП-J 76
3.2.4.2. Исследование выделенных изолятов ВЛП-J на
контаминацию 76
3.2.4.3. Определение нуклеотидной последовательности генома выделенных изолятов ВЛП-J 77
3.2.5. Изучение биологических свойств штамма ALV-J/ CLB-908U .78
3.2.6. Получение культурального препарата антигена ВЛП для использования в серологических реакциях 81
3.2.6.1. Криоконсервирование первично-трипсинизированных клеток фибробластов эмбрионов кур .81
3.2.6.2. Подбор условий для получения антигена ВЛП .89
3.2.6.2.1. Определение оптимального срока инкубации штамма вируса ALV-J/CLB-908U 89
3.2.6.2.2. Определение оптимальной инфицирующей концентрации штамма ALV-J/CLB-908U .90
3.2.6.3. Очистка и концентрирование культурального антигена ВЛП .91
3.2.7. Разработка тест-системы для выявления антител к ВЛП в непрямом варианте ИФА 93
3.2.7.1. Определение рабочей концентрации антигена ВЛП 94
3.2.7.2. Проверка специфичности антигена ВЛП .95
3.2.7.3. Исследование стабильности антигена ВЛП во время хранения при 4С .96
3.2.7.4. Получение контрольных сывороток к ВЛП 97
3.2.7.5. Определение оптимального разведения исследуемых сывороток и
выведение уравнения для вычисления титра исследуемых сывороток .97
3.2.7.6. Определение позитивно-негативного порога 103
3.2.7.7. Выбор допустимых значений контрольных сывороток .104
3.2.7.8. Определение воспроизводимости метода 106
3.2.7.9. Оценка чувствительности, специфичности, точности, степени согласованности полученных результатов разработанной тест-системы по отношению к коммерческому набору фирмы IDEXX . 110
3.2.8. Применение разработанной тест-системы при проведении скрининговых исследований сывороток крови на антитела к ВЛП .112
4. Обсуждение результатов исследований 114
5. Выводы 128
6. Практические предложения .130
7. Список литературы
