ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ............................................................. 6
ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................ 15
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................... 19
1.1. Атеросклероз как многофакторное заболевание ................................... 19
1.1.1. Понятие атеросклероза, общие сведения ......................................... 19
1.1.2. Основные типы атеросклеротических поражений ......................... 21
1.2. Роль моноцитов и макрофагов в атерогенезе ........................................ 24
1.2.1. Характеристика субпопуляций макрофагов .................................... 24
1.2.2. Участие макрофагов в формировании атеросклеротических
поражений ........................................................................................................ 30
1.3. Связь митохондриальной дисфункции с возникновением и развитием
атеросклероза ...................................................................................................... 33
1.3.1. Основные последствия развития митохондриальной дисфункции в
клетках атеросклеротических поражений .................................................... 33
1.3.2. Структура, функции и механизмы регуляции митохондриального
генома ............................................................................................................... 36
1.3.3. Корреляция мутаций митохондриального генома с развитием
атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний ................................... 40
1.4. Использование современных методов для исследования атерогенеза in
vitro 46
1.4.1. Клеточные модели исследования атеросклероза ............................... 46
1.4.2. Основные подходы к редактированию митохондриального генома
........................................................................................................................... 49
1.5. Заключение к обзору литературы ........................................................... 58
3
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .................................................................. 60
2.1. Работа с культурами клеток .................................................................... 60
2.1.1 Клеточные линии ................................................................................... 60
2.1.2 Протокол культивирования моноцитоподобных клеточных линий и дифференцировки в макрофагоподобные клетки ....................................... 62
2.1.3 Трансфекция клеток катионными липосомами и вектором MitoCas9 ........................................................................................................................... 62
2.2. Молекулярно-биологические методы .................................................... 64
2.2.1 Выделение ДНК из образцов клеток ................................................... 64
2.2.2 Выделение РНК из образцов клеток и проведение реакции обратной транскрипции для получения комплементарной ДНК ............................... 65
2.2.3 Количественная полимеразная цепная реакция ................................. 66
2.2.4 Т7-анализ эффективности внесения двуцепочечных разрывов в митохондриальной ДНК ................................................................................. 68
2.2.5 Цифровая капельная полимеразная цепная реакция .......................... 69
2.3. Биохимические методы ............................................................................ 70
2.3.1 Электрофорез в агарозном геле ............................................................ 70
2.3.2 Иммуноферментный анализ провоспалительных цитокинов ........... 71
2.3.3 Выделение суммарной фракции ЛПНП из плазмы крови ................. 73
2.3.4 Определение содержания общего холестерина и общего белка ....... 74
2.3.5 Определение скорости потребления кислорода клетками ................ 75
2.4. Микроскопия ............................................................................................. 78
2.4.1 Оценка жизнеспособности клеток ....................................................... 78
2.4.2 Оценка колокализации митохондрий и лизосом при помощи конфокальной микроскопии .......................................................................... 79
2.5. Проточная цитофлуориметрия ................................................................ 80
4
2.5.1 Оценка уровня АФК, генерируемого клетками, и перекисного окисления липидов ......................................................................................... 80
2.5.2 Анализ мембранного потенциала митохондрий ................................. 81
2.6. Статистическая обработка данных ......................................................... 82
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ...................................................... 84
3.1. Удаление мтДНК, несущей мутацию m.15059G>A в гене MT-CYB, при помощи РНК-комплекса MitoCas9 в клетках линии цитоплазматических гибридов TC-HSMAM1. .................................................................................... 84
3.2. Оценка митохондриальной дисфункции по отношению к изменению уровня митохондриального мембранного потенциала, продукции АФК и образования продуктов перекисного окисления липидов митохондриальной мембраны в цитоплазматических гибридах TC-HSMAM1 и клетках Cas9-TC-HSMAM1. ............................................................................................................ 90
3.3. Анализ скорости потребления кислорода и митохондриального биоэнергетического профиля клеток цибридных линий TC-HSMAM1 и Cas9-TC-HSMAM1 ............................................................................................. 93
3.4. Оценка митохондриальной дисфункции по отношению к активации митофагии в клетках линий THP-1, цибридов TC-HSMAM1 и Cas9-TC-HSMAM1 ............................................................................................................. 97
3.5. Анализ экспрессии генов, опосредующих митофагию, в клетках линий THP-1, цибридов TC-HSMAM1 и цибридов Cas9-TC-HSMAM1. .............. 101
3.6. Оценка секреции цитокинов клетками линий THP-1, TC-HSMAM1 и Cas9-TC-HSMAM1 в условиях активации провоспалительного ответа .... 103
3.7. Оценка способности клеток линий THP-1, TC-HSMAM1 и Cas9-TC-HSMAM1 формировать эндотоксиновую толерантность к ЛПС. .............. 107
5
3.8. Анализ экспрессии генов, ассоциированных с формированием инфламмасомы, в клетках линий THP-1, TC-HSMAM1 и Cas9-TC-HSMAM1. 108
3.9. Оценка накопления внутриклеточного холестерина липопротеидов низкой плотности клетками линий TC-HSMAM1 и Cas9-TC-HSMAM1 ... 111
3.10. Оценка регуляции внутриклеточного метаболизма липидов в клетках линий THP-1, цибридов TC-HSMAM1 и Cas9-TC-HSMAM1 в условиях инкубации с ЛПНП. ......................................................................................... 113
3.11. Анализ экспрессии генов, регулирующих апоптоз, в клетках линий THP-1, цибридов TC-HSMAM1 и цибридов Cas9-TC-HSMAM1. .............. 116
3.12. Анализ экспрессии генов, регулирующих пролиферацию и клеточный цикл, в клетках линий THP-1, TC-HSMAM1 и Cas9-TC-HSMAM1. .......................................................................................................... 118
3.13. Анализ экспрессии генов, ассоциированных с синтетической активностью и регуляцией транскрипции, в клетках линий THP-1, TC-HSMAM1 и Cas9-TC-HSMAM1. .................................................................... 119
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ....................................................... 122
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................... 145
ВЫВОДЫ ............................................................................................................. 147
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................. 149
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................... 151
