Введение
1 Список сокращений 5
2 Введение 7
3 Обзор литературы. Амилоиды и их взаимодействие
3.1 Определение термина «амилоид» 12
3.2 История формирования представлений об амилоидах
3.2.1 Описание заболеваний, связанных с амилоидами 12
3.2.2 Изучение структуры амилоидов 15
3.2.3 Определение состава амилоидов 16
3.3 Разнообразие амилоидов 18
3.3.1 Патологические амилоиды 18
3.3.2 Функциональные амилоиды 21
3.3.3 Прионы как подгруппа амилоидов
2.3.3.1 Прионы млекопитающих 24
2.3.3.2 Прионы грибов 27
2.3.3.2.1 Фактор [PSI+] 31
2.3.3.2.1 Фактор [PIN+] 33
3.4 Структура амилоидов 34
3.4.1 Особенности аминокислотной последовательности 34
3.4.2 Особенности пространственной структуры амилоидов
3.5 Взаимодействие амилоидов 41
3.6 Методы идентификации амилоидов
3.6.1 Биоинформатические методы 44
3.6.2 Биохимические методы 47
3.7 Заключение 49
4 Материалы и методы 51
4.1 Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования 51
4.2 Плазмиды 52
4.2.1 Плазмиды, полученные в данной работе 54
4.3 Генетические методы 65
4.4 Молекулярно-биологические методы 66
4.5 Белковый электрофорез и «Вестерн-блот» гибридизация 68
4.6 Конфокальная микроскопия 69
4.7 Разработка алгоритма SARP для поиска последовательностей, богатых аспарагином и глутамином 70
4.8 Протеомный скрининг и идентификации амилоидов 70
4.8.1 Выделение фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработке детергентами 71
4.8.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография, совмещенная с масс спектрометрией (HPLC-MALDI) 72
4.9 Предсказание -арок 73
4.10 Статистические методы 73
5. Результаты 74
5.1 Анализ амилоидогенных свойств вариантов N-терминального домена Sup35 с заменами глутамина на аспарагин и фенилаланин 74
5.1.1 Изучение способности вариантов N-терминального домена Sup35 агрегировать 74
5.1.2 Изучение способности вариантов N-домена Sup35 индуцировать прионизацию нативного белка Sup35 77
5.2 Изучение влияния аминокислотных замен в N-домене Sup35 на индукцию
амилоидогенеза других белков в протеоме дрожжей 80
5.2.1 Выявление потенциально амилоидогенных белков методом PSIA-HPLC MALDI 80
5.2.2 Разработка нового алгоритма поиска потенциально амилоидогенных белков in silico 82
5.3 Изучение амилоидных свойств белка Mad1 85
5.4 Влияние прионов [PSI+] и [PIN+] на агрегацию QN-богатого фрагмента белка Gln3 89
5.4.1 Изучение влияния [PIN+] и [PSI+] на агрегацию QN-богатого фрагмента белка Gln3 89
5.4.2 Анализ колокализации QN-богатого фрагмента белка Gln3 с белками Sup35 и Rnq1 93
6 Обсуждение 97
6.1 Влияние замен глутамина на аспарагин или фенилаланин в N терминальном домене белка Sup35 на его свойства 97
6.2 Влияние сверхпродукции N-домена Sup35 на индукцию амилоидогенеза других белков в дрожжевом протеоме 100
6.3 Белок Mad1 формирует амилоидоподобные олигомеры не зависимо от присутствия агрегатов N-терминального домена Sup35 102
6.4 Прионы [PSI+] и [PIN+] оказывают различное влияние на агрегацию QN богатого фрагмента белка Gln3 104
7 Заключение 107
8 Выводы 108
9 Список литературы 109
