Введение
1 Обзор литературы 15
1.1 Десмосома 15
1.1.1 Струкура и функции десмосом 15
1.1.2 Белки семейства armadillo 19
1.1.3 Плакофиллины. Плакофиллин-2 20
1.2 Сигнальный путь Wnt 22
1.1.1 Канонический сигнальный путь Wnt 24
1.3 Стволовые клетки 26
1.3.1 Понятие стволовой клетки 26
1.3.2 Резидентные стволовые клетки 27
1.3.3 Плюрипотентные стволовые клетки 28
1.3.4 Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки
1.3.4.1 Индукция плюрипотентности 28
1.3.4.2 Методы получения иПСК человека 29
1.3.4.3 Характеристика иПСК человека 32
1.3.4.4 Дифференцировка иПСК в кардиомиоциты 33
1.3.4.5 Характеристика кардиомиоцитов, полученных из иПСК 34
1.4 Моделирование заболеваний человека с помощью иПСК 36
1.4.1 Моделирование кардиомиопатий с помощью иПСК 36
1.5 Аритмогенная кардиомиопатия 37
2 Материалы и методы 43
2.1 Клеточные культуры, использовавшиеся в работе 43
2.1.1 Культивирование линии клеток HL-1 43
2.1.2 Получение, культивирование и криоконсервация ММСК жировой ткани 43
2.1.3 Получение, культивирование и криоконсервация мезенхимных клеток сердца 44
2.1.4 Иммунофенотипирование культур ММСК и мезенхимных клеток сердца 45
2.1.5 Индукция адипогенной дифференцировки ММСК и мезенхимных клеток сердца 45
2.1.6 Индукция кардиогенной дифференцировки мезенхимных клеток сердца 45
2.1.7 Получение, культивирование и дифференцировка иПСК 45
2.1.7.1 Получение иПСК 45
2.1.7.2 Культивирование иПСК 47
2.1.7.3 Криоконсервация иПСК 47
2.1.7.4 Формирование тератом из иПСК 47
2.1.7.5 Формирование эмбриоидных тел из иПСК 48
2.1.7.6 Дифференцировка иПСК в направлении кардиомиоцитов
2.2 Выделение РНК и проведение реакции обратной транскрипции 49
2.3 Полуколичественная ПЦР 50
2.4 ПЦР в режиме реального времени 50
2.5 Реакция на щелочную фосфатазу 51
2.6 Иммуноцитохимическая окраска клеток 51
2.7 Электронная микроскопия 52
2.8 Электрофорез в ПААГ и вестерн-блоттинг 52
2.9 Измерение люциферазной активности 53
2.10 Получение лентивирусных конструкций, несущих ген PKP2 дикого типа и его мутантные формы 53
2.10.1 Клонирование кодирующей последовательности PKP2 в лентивирусный вектор 53
2.10.2 Сайт-специфический мутагенез 54
2.10.3 Секвенирование участков плазмид 54
2.10.4 Продукция лентивирусных частиц 2.11 Трансдукция клеточных культур 56
2.12 Статистическая обработка данных 56
2.13 Последовательности праймеров и готовые смеси TaqMan 56
3 Результаты 62
3.1 Идентификация носителей мутаций генов десмосомы среди пациентов с аритмогенной кардиомиопатией 62
3.2 Выбор экспериментальной модели для изучения патогенеза АКМП 63
3.3 Получение и характеристика первичных клеточных культур
3.3.1 Получение культуры ММСК жировой ткани 64
3.3.2 Получение культуры мезенхимных клеток сердца 65
3.4 Получение и дифференцировка линий иПСК 68
3.4.1 Получение и характеристика линий иПСК 68
3.4.2 Дифференцировка иПСК в направлении кардиомиоцитов 72
3.5 Характеристика кардиомиоцитов, полученных от пациентов с АКМП 74
3.5.1 Характеристика дифференцированных кардиомиоцитов пациента АКМП1 75
3.5.2 Сравнительная характеристика кардиомиоцитов от пациентов с АКМП 79
3.6 Изучение активности сигнального пути Wnt в ходе дифференцировки иПСК от пациентов сАКМП 81
3.7 Поиск потенциальных мишеней сигнального пути Wnt в ходе дифференцировки иПСК от пациентов сАКМП 84
3.8 Получение и характеристика лентивирусных конструкций, несущих ген PKP2 дикого типа и его мутантные формы 87
3.8.1 Получение лентивирусных конструкций, несущих ген PKP2 дикого типа и его мутантные формы 87
3.8.2 Характеристика экспрессии лентивирусных конструкций, несущих ген PKP2 и его мутантные формы, в клетках линии HL1 88
3.8.3 Характеристика экспрессии лентивирусных конструкций, несущих ген PKP2 дикого типа и его мутантные формы, в ИПСК 90
3.9 Изучение влияния мутаций гена PKP2 на ультраструктурную организацию десмососом в клетках линии HL-1 92
3.10 Изучение влияния уровня экспрессии PKP2 дикого типа на активность канонического сигнального пути Wnt в ходе дифференцировки иПСК 93
3.11 Изучение влияния мутаций гена PKP2 на активность канонического сигнального пути Wnt в ходе дифференцировки иПСК 94
3.12 Оценка активности канонического сигнального пути Wnt в первичных клеточных культурах 96
Обсуждение 101
Выводы 109
Список литературы
