Введение
1 Обзор литературы 11
1. Строение и функция SRP и SR из клеток животных 11
1.1. Структура 7SL РНК 12
1.2. Структура Alu-домена SRP 13
1.3. Структура S-домена SRP 16
1.4. Структура комплекса рибосома/сигнальный nenmud/SRP 22
1.5. Биогенез SRP 24
1.6. Структура SR 25
1.7. Структура комплекса рибосома/сигнальный nenmud/SRP/SR 30
1.8. Функция SRP и SR: ранние исследования 32
1.9. Функция SRP и SR: сигнальные последовательности 34
1.10. Функция SRP и SR: распределение функций между доменами SRP 36
1.11. Функция SRP и SR: арест трансляции 38
1.12. Функция SRP и SR: длина растущего пептида 39
1.13. Функция SRP и SR: SRP - шаперон 41
1.14. Функция SRP и SR: SRP54 и сигнальный пептид 41
1.15. Функция SRP и SR: взаимодействие SRP и SR, гидролиз GTP 41
1.16. Функция SRP и SR: взаимодействие рибосомы uSRcc 44
1.17. Функция SRP и SR: роль SR/3 45
1.18. Функция SRP и SR: дополнительная функция гетеродимера SRP9/SRP14 47
1.19. Функция SRP и SR: SRP в посттрансляционном транспорте белков 47
2. Строение и функция SRP и SR-ИЗ клеток S. cerevisiae 48
2.1. Структура scRl РНК 49
2.2. Структура Alu-домена SRP 50
2.3. Структура S-домена SRP 51
2.4. Биогенез SRP 51
2.5. Структура SR 53
2.6. Функция SRP и SR: общие полоэюения 54
2.7. Функция SRP и SR: нарушение генов компонентов SRP 56
3. Строение и функция SRP и SR-ИЗ клеток Е. coli 59
3.1. Структура Fjh 59
3.2. Структура 4.5SРНК 63
3.3. Структура комплекса 4.5S PHK/FfhM. 65
3.4. Структура FtsY 66
3.5. Структура комплекса FjhNG/FtsYNG 67
3.6. Функция SRP и SR: ранние исследования 69
3.7. Функция SRP и SR: взаимодействие Fjh с 4.5S РНК 71
3.8. Функция SRP и SR: общая схема работы SRP бактерий 72
3.9. Функция SRP и SR: взаимодействие SRP и SR, гидролиз GTP 74
3.10. Функция SRP и SR: роль SecA 76
3.11. Дополнительная функция 4.5S РНК 77
4. Заключение 78
2 Результаты и обсуждение 79
1. Взаимодействие SRP с рибосомой Е. coli 79
1.1. Влияние остатков 4-muo-U в составе 4.5S РНК* на образование комплекса FJh-6His/4.5S РНК 79
1.2. Образование комплексаpu6ocoMa/Ffh-6His/muo-4.5S РНК*, фотохимическое сшивание 81
1.3. Изучение взаимодействия 4.5S РНК* с рибосомными белками 83
1.4. Изучение взаимодействия 4.5SPHK* с 23Su 16S Ррнк 84
1.5. Определение остатков 4-muo-U в 4.5S РНК*, участвующих в образовании сшивок 87
1.6. Модель взаимодействия 4.5S РНК с рибосомой 90
2. Влияние нарушения синтеза SRa на биосинтез компонентов SRP-пути и на взаимодействие SRP с рибосомой в клетках S. cerevisiae 95
2.1. Создание штамма дрожжей с регулируемой экспрессией SRa 95
2.2. Зависимость количества компонентов SRP-пути от количества SRa в клетке 97
2.3. Влияние нарушения синтеза SRa на взаимодействие SRP с рибосомой 103
3. Влияние нарушения синтеза FtsY на биосинтез белкового компонента SRP в клетках . coli 107
3.1. Создание бактериального штамма с регулируемой экспрессией белка FtsY 107
3.2. Зависимость количества Ffh от количества FtsY в клетке 108
3 Материалы и методы 111
1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы, олигодезоксирибонуклеотиды, штаммы 111
2. Клонирование 117
2.1. Выделение плазмидной ДНК 117
2.2. Определение концентрации ДНК в растворе 117
2.3. ПЦР 117
2.4. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле 118
2.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 118
2.6. Приготовление векторов и вставок 118
2.7. Цитирование 119
2.8. Приготовление компетентных клеток Е. coli 119
2.9. Трансформация компетентных клеток Е. coli 119
2.10. Определение первичной структуры ДНК по Сэнгеру 120
3. Получение 4.5SРНК*, определение соотношения muo-U:Ue 4.5SPHK* 121
3.1. Создание конструкции pSL-ffs 121
3.2. Получение 4.5S РНК* с помощью Т7-транскрипции 121
3.3. Определение соотношения 4-THO-U:U в полученной 4.5S РНК 122
4. Выделение белка Fjh-6His 123
4.1. Создание конструкции pET-Ffh-6His 123
4.2. Выделение белка Ffh-6His HaNi-NTA агарозе 123
4.3. Электрофоретическое разделение белков в SDS-ПААГ 124
5. Образование комплекса 4.5S PHK*/Fjh-6His 125
6. Получение мРНК р-лактамазы 125
7. Трансляция мРНК Р-лактамазы in vitro, выделение транслирующих рибосом 126
7.1. Трансляция мРНК р-лактамазы in vitro 126
7.2. Трансляция мРНК р-лактамазы in vitro 126
7.3. Выделение транслирующих рибосом 126
8. Фотохимическое сшивание комплекса 4.5S PHK*/Ffh-6His с рибосомами 126
9. Анализ продуктов фотохимического сшивания 127
9.1. Пошаговое центрифугирование 127
9.2. Гидролиз 4.5S РНК*, 16S и 23S рРНК с помощью рибонуклеазы Н 128
9.3. Гидролиз 4.5S РНК* и фотоадцукта 4.5S РНК* с 23S рРНК с помощью рибонуклеазы ТІ 128
9.4. Анализ фотоадцуктов 4.5S РНК* с рибосомными белками с помощью антител 129
10. Создание дрожжевых штаммов ONA11 и ONA 72 129
10.1. Получение ПЦР-фрагмента I 129
10.2. Трансформация клеток S. cerevisiae 129
10.3. Выделение геномной ДНК S. cerevisiae 130
10.4. ПЦР с геномной ДНК S. cerevisiae 131
10.5. Иммунодетекция белка Srp72p-4,5Z в клетках S. cerevisiae 131
10.6. Вестерн-блоттинг белков 131
11. Детекция scRl РНК и мРНК белков Srpl4p, Srp21p, Sec65p, а- и (3-субъединиц SR, карбоксипептидазы Y 132
11.1. Наращивание клеток S. cerevisiae 132
11.2. Выделение суммарной РНК из клеток S. cerevisiae методом горячей фенольной депротеинизации 133
11.3. Приготовление зондов для нозерн-блот-анализа 133
11.4. Нозерн-блот-анализ scRl РНК и мРНК белков SrpHp, Srp21p, Sec65p, а- и р-субъединиц SR, карбоксипептидазы Y 134
12. Анализ количества белка Srp72р-4,5Z в клеточных фракциях S. cerevisiae 135
13. Создание штамма XDPBADFISY 136
13.1. Создание конструкции pET23-Py-kanR-PBAoFtsY 136
13.2. Получение ПЦР-фрагмента II 137
13.3. Трансформация клеток Х90 (DE3), содержащих плазмиду pKD46, ПЦР-фрагментом II 138
14. Вестерн-блот-анализ белков FtsY и Fjh 139
Выводы 140
