Введение
Глава 1 Обзор литературы 11
1.1 Липолитические ферменты 11
1.1.1 Общие сведения 11
1.1.2 Природные продуценты липолитических ферментов 14
1.1.3 Свойства бактериальных липолитических ферментов 15
1.1.4 Экспрессия рекомбинантных бактериальных липолитических ферментов 19
1.2 Биокатализаторы на основе бактериальных липолитических ферментов 21
1.2.1 Методы, применяемые для иммобилизации липолитических ферментов 21
1.2.2 Применение биокатализаторов на основе бактериальных липолитических ферментов в биотехнологии 25
1.2.2.1 Биоразложение пестицидов в сточных водах 25
1.2.2.2 Получение биодизельного топлива 27
1.2.2.3 Получение модифицированных пищевых жиров 31
Глава 2 Материалы и методы 34
2.1 Материалы и реактивы 34
2.2 Микробиологические методы анализа 35
2.3 Молекулярно-генетические методы 36
2.3.1 Определение таксономической принадлежности бактерий 36
2.3.2 Получение рекомбинантной эстеразы estUT1 37
2.4 Биохимические методы исследования 38
2.5 Иммобилизация ферментов 42
2.5.1 Метод поперечной сшивки агрегатов белка 42
2.5.2 Метод ковалентной иммобилизации белка 45
2.6 Аналитические методы исследования 47
2.7 Статистическая обработка данных 50
Глава 3 Результаты и обсуждение 51
3.1 Выделение и идентификация термофильных бактерий с липолитической активностью из природных образцов 52
3.2 Получение и исследование свойств рекомбинантной эстеразы бактерии U. thermosphaericus 55
3.2.1 Филогенетический анализ эстеразы estUT1 55
3.2.2 Получение рекомбинанатной эстеразы estUT1 58
3.2.3 Моделирование трехмерной структуры estUT1 60
3.2.4 Исследование свойств эстеразы estUT1 61
3.3 Исследование влияния коэкспрессии с шаперонами E. coli на продукцию эстеразы estUT1 68
3.4 Характеристика ферментов, использованных в данной работе, и обоснование их применения в составе биокатализаторов для различных биотехнологических процессов 70
3.5 Иммобилизация липолитических ферментов и их применение в процессах очистки муниципальных сточных вод, а также получения биодизельного топлива и модифицированных жиров 72
3.5.1 Применение рекомбинантной иммобилизованной эстеразы estUT1 в реакции биокаталитического гидролиза малатиона в стерилизованных муниципальных сточных водах 72
3.5.1.1 Приготовление биокатализатора CLEA-estUT1 на основе эстеразы estUT1 72
3.5.1.2 Исследование свойств биокатализатора CLEA-estUT1 79
3.5.1.3 Применение CLEA-estUT1 в реакции гидролиза малатиона 83
3.5.2 Применение рекомбинантной иммобилизованной липазы бактерии G. stearothermophilus G3 для получения МЭЖК и переэтерифцированных масложировых смесей 84
3.5.2.1 Приготовление биокатализатора БКЛ на основе липазы G3 84
3.5.2.2 Применение биокатализатора БКЛ в реакции переэтерификации подсолнечного масла с метанолом для получения МЭЖК 85
3.5.2.2.1 Исследование влияния различных факторов на выход МЭЖК 85
3.5.2.2.2 Операционная стабильность биокатализатора БКЛ в реакции переэтерификации подсолнечного масла с метанолом 89
3.5.2.3 Применение биокатализатора БКЛ в реакции переэтерификации смеси подсолнечного и гидрированного соевого масла для получения модифицированных жиров 90
3.5.2.3.1 Исследование влияния различных факторов на степень ферментативной переэтерификации масел 90
3.5.2.3.2 Операционная стабильность биокатализатора БКЛ в реакции переэтерификации смеси подсолнечного и гидрированного соевого масла 93
3.5.2.3.3 Физико-химические характеристики продуктов реакции переэтерификации смеси подсолнечного и гидрированного соевого масла 94
3.6 Характеристика полученных в работе биокатализаторов 97
Заключение 102
Выводы 104
Список сокращений 105
Список литературы 107
Приложение А 128
