Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Современные представления о структуре холерного токсина 13
1.2 Методы обнаружения холерогена in vitro 18
1.3 Моноклональные антитела к холерному токсину 28
Собственные исследования
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Бактериальные штаммы и условия их выращивания 33
2.2 Бактериальные токсины и антитоксические сыворотки 33
2.3 Ганглиозиды 40
2.4 Перевиваемые клеточные линии и их культивирование 40
2.5 Лабораторные животные 41
2.6 Гибридизация клеток 41
2.7 Культивирование гибридом in vivo и in vitro 42
2.8 Скрининг моноклональных антител в культуральных жидкостях гибридом 42
2.9 Клонирование гибридом 42
2.10 Криоконсервирование 43
2.11 GMl-иммуноферментный анализ (GMl-ИФА) 43
2.12 GM1-дот-иммунологический анализ (GMi-ДИА) 43
2.13 СНО-иммуноферментный анализ (СНО-ИФА) 44
2.14 Сэндвич-иммуноферментный анализ двойных антител (ИФА-2АТ) 44
2.15 Тест в культуре клеток 44
2.16 Иммуноблоттинг препаратов холерного токсина 45
2.17 Фотографирование 45
2.18 Статистическая обработка результатов 45
Глава 3. Монослойные клеточные линии в тестировании холерного токсина
3.1 Характеристика препаратов XT и антитоксических сывороток 46
3.2 Особенности тестированиясупернатантов ctxf штаммов V.cholerae 01, V.cholerae 0139 и V.cholerae поп 01/поп 0139 в культуре клеток СНО-К1 49
3.3 Тестирование супернатантов ctx" штаммов V.cholerae 01 в культуре клеток 53
Глава 4. Варианты иммуноферментного метода для выявления холерогена с использованием ганглиозидов GM1 и поликлональных антитоксических сывороток
4.1 Применение варианта GMl-ИФА для обнаружения и количественного определения XT 56
4.2 Отработка условий постановки дот-иммунологического анализа (ДИА) с использованием ганглиозидов GM1 и нитроцеллюлозной мембраны 61
4.3 Разработка твердофазного СНО-ИФА для обнаружения XT 65
Глава 5. Получение и характеристика моноклональных антител к холерному токсину
5.1 Получение гибридом- продуцентов МКА к XT и их первичный скрининг 68
5.2 Определение эпитопной направленности моноклональных антител к XT 71
5.3 Определение класса и подкласса моноклональных антител 73
5.4 Изучение специфичности и активности МКА к XT 75
5.5 Токсиннейтрализующие свойства МКА 75
5.6 Получение препаративных количеств МКА 76
5.7 Изучение способности МКА взаимодействовать с XT после его связывания с ганглиозидами GM1 77
5.8 Разработка ИФА с использованием МКА к холерному токсину (ИФА-2АТ) 79
5.9 Оценка чувствительности различных вариантов ИФА 81
5.10 Изучение влияния различных биологически активных веществ на специфичность ИФА 82
4 Глава 6. Аспекты применения методов in vitro для тестирования холерного токсина 6.1 Культура клеток в изучении биологической активности токсинов V.cholerae, продуцируемых рекомбинантными штаммами Escherichia coli 85
6.2. Изучение влияния условий хранения и обеззараживания препаратов холерогена на его активность с помощью ИФА и культуры клеток СНО-К1 91
6.3 Влияние условий культивирования на токсинопродуцирующую активность штаммов V.choleraeOX и V.cholerae 0139 93
6.4 Оценка качества очистки препаратов ХТ-0139 с использованием МКА к ЛПС-0139 96
Заключение 99
Выводы 108
Список литературы ПО
