Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 ТГц излучение: генерация и свойства 12
1.2 Электромагнитное излучение – как фактор воздействия на живые организмы 18
1.2.1 Геносенсорные конструкции в исследовании устойчивости и адаптации биологической системы к конкретным воздействиям 25
1.3 Механизмы регуляции стрессовых реакций E. coli 29
1.3.1 Окислительный стресс 30
1.3.2 Гомеостаз ионов меди 40
1.3.3 Оперон EmrRAB 47
1.4. Глутамин синтетаза в регуляторных контурах E. coli 49
1.4.1. Функции глутатиона в E. coli 52
1.5 Заключение по обзору литературы 57
ГЛАВА 2. Материалы, методы и приборная база 59
2. 1 Материалы 59
Реактивы 59
Бактериальные штаммы 59
Культуральные среды 60
Ферменты 60
Плазмиды 61
2. 2 Методы 62
Дизайн олигонуклеотидов для амплификации фрагментов ДНК 62
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 62
Очистка продуктов ПЦР 63
Лизис E. coli 63
Выделение плазмидной ДНК 63
Электрофорез в агарозном геле 64
Выделение фрагментов ДНК из агарозы 64
Клонирование 65
Получение базового вектора pUC18-GFP и плазмидных конструкций pCopA-GFP и pGlnA GFP 67
Приготовление компетентных клеток E. coli 68
Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК 68
Секвенирование плазмидных ДНК 69
Индукция синтеза флюоресцентного белка GFP в клетках геносенсоров 70
Измерение уровня флюоресценции клеток геносенсоров 72
Облучение клеток ТГц излучением 72
Подсчет количества клеток на агаризованных средах 73
2. 3 Приборная база 73
Источник ТГц излучения 73
Рабочая станция для облучения биологических объектов 75
2.4 Статистическая обработка данных 77
ГЛАВА 3. Результаты 80
3.1 Плазмидные конструкции 80
3.2 Определение оптимальных концентраций естественных индукторов для геносенсоров
3.2.1 Тестирование геносенсора на основе промотора гена katG 83
3.2.2 Тестирование геносенсора на основе промотора гена copA 87
3.2.3 Тестирование геносенсора на основе промотора гена emrR 90
3.3 Сравнительное изучение индукции геносенсоров Е. coli/pKatG-GFP, Е. coli/pCopA-GFP, Е. coli/pEmrR-GFP, Е. coli/pGlnA-GFP перекисью водорода, сульфатом меди и салициловой кислотой 91
3.4 Облучение клеточных культур геносенсоров 3.4.1 Облучение геносенсора E. coli/pKatG-GFP и его реакция на нетермическое воздействие ТГц излучения 94
3.4.2 Облучение геносенсоров E. coli/pCopA-GFP, E. coli/pEmrR-GFP и их реакция на нетермическое воздействие ТГц излучения 101
3.4.4 Облучение геносенсора E. coli/pGlnA-GFP и его реакция на нетермическое воздействие ТГц излучения 103
3.5 Сравнение силы ответа геносенсоров на нетермическое воздействие ТГц излучения 104
3.6 Облучение минимальных сред и их влияние на культуры геносенсоров
3.6.1 Индукция флюоресцентного ответа при облучении минимальной среды и при отделении облученных клеток от минимальной среды 106
3.6.2 Индукционный эффект от облученной минимальной среды, подвергавшейся разведениям 112
3.6.3 Время сохранения индукционной силы среды 114
3.6.4 Разделение минимальной среды на компоненты 115
3.6.5 Эффект от минимальной среды, облученной с разной мощностью 119
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 121
Заключение 140
Выводы 142
Список литературы 143
