Введение
ГЛАВА 1. ФЕРМЕНТЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В РЕПАРАЦИИ 8-ОКСОГУАНИНА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 11
1.1. Системы репарации 8-оксогуанина в клетках про-и эукариот 13
1.2. 8-Оксогуашш-ДНК глнкозилазы 15
1.2.1.8-Оксогуаиин-ДНК гликозилазы прокариот 15
1.2.1.1. Структура Fpg прокариот , 16
1.2.1.2. Субстратная специфичность Fpg прокариот 17
1.2.1.3. Каталитический механизм Fpg прокариот 20
1.2.1.4. Конформационные перестройки комплексов Fpg прокариот с ДНК 24
1.2.1.5. Взаимодействие Fpg прокариот с остатком oxoG поврежденной ДНК.. 27
1.2.1.6. Взаимодействие Fpg прокариот с цепью ДНК, комплементарной поврежденной 31
1.2.1.7. Поиск oxoG в структуре ДНК прокариотическими Fpg ферментами . 32
1.2.2.8-Оксогуанин-ДНК гликозилазы эукариот 35
1.2.2.1. Структура AOggl , 36
1.2.2.2. Субстратная специфичность Oggl эукариот 37
L2.2.3. Каталитический механизм Oggl эукариот 38
1.2.2.4. Конформационные перестройки в комплексе hOggl-oxoG-ДНК 42
1.2.2.5. Поиск в геноме остатков oxoG ферментом hOggl , 45
1.3. Аденин-ДНК гликозилазы 48
1.3.1. Аденин-ДНК гликозилазы прокариот 48
1.3.1.1. Структура MutY прокариот 48
1.3.1.2. Субстратная специфичность MutY прокариот 49
1.3.1.3. Каталитический механизм MutY прокариот 51
1.3.1.4. Конформационные перестройки в комплексах MutY прокариот с oxoGiA-содержащей ДНК 53
1.3.1.5. Взаимодействие MutY прокариот с остатком oxoG ДНК-субстрата . 54
1.3.2. Аденин-ДНК гликозилазы эукариот 55
1.4.8-Оксогуанозинтрифосфатазы 56
1.4,1. 8-Оксогуанозинтрифосфатазы прокариот , 56
1.4.1.1. СтруктураMutTЕ. coli 56
1.4.1.2. Субстратная специфичность MutTЕ. coli 57
1.4.1.3. Каталитический механизм MutT E. coli 58
1.4.2. 8-Оксогуанозинтрифосфатазыэукариот 59
L4.2.L Структура 8-оксогуанозинтрифосфатаз эукариот 59
1,4.2.2. Субстратная специфичность 8-оксогуанозинтрифосфатаз эукариот... 61
ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТА РЕПАРАЦИИ
ФОРМАМИДОПИРИМИДИН-ДНК ГЛИКОЗИЛАЗЫ Е. COLIC ФОСФАТНЫМИ
ГРУППАМИ ДНК (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ) 65
2.1. Экспрессия и выделение формамидопиримидин-ДНК гликозилазы Е. coli ... 67
2.2. Дизайн и синтез модифицированных ДНК-дуплексов, содержащих пирофосфатные и замещенные пирофосфатные межнуклеотидные группы 69
2.3. Исследование структуры модифицированных ДНК-дуплексов комбинированным методом квантовой и молекулярной механики 76
2.3.1. Выбор модельной системы 77
2.3.2. Оптимизация геометрических параметров 79
2.3.3. Сравнение теоретических и экспериментальных данных для структуры модифицированного ДНК-дуплекса , , 81
2.3.4. Влияние пирофосфатной и реакционноспособной О-этилзамещенной пирофосфатной групп на структуру ДНК-дуплексов 84
2.3.5. Электронное строение пирофосфатной и О-этилзамещенной пирофосфатной групп в составе ДНК 87
2.4. Специфическое связывание модифицированных ДНК-дуплексов с
формамидопиримидин-ДНК гликозилазой Е. coli 89
2.4.1. Определение констант диссоциации комплексов модифицированных аналогов субстратов сферментом 89
2.4.2. Доказательство специфичности связывания , 91
2.5. Каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов
формамидопиримидин-ДНК гликозилазой Е. coli 93
2.5.1. Определение кинетических констант каталитического расщепления
модифицированных аналогов субстратов ферментом 94
2.5.2, Изучение взаимодействия ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные межнуклеотидные группы, с 8-оксогуании-ДНК гликозилазой человека (hOggl) 99
2.5.3. Изучение механизма взаимодействия ферментов Fpg Е. сой и hOggl с ДНК-дуплексами, содержащими модифицированные межнуклеотидные группы в 3- и 5-положениях остатка 8-оксогуанозина 105
2.6. Региоспецифическое ковялентнос связывание Fpg Е. coli с ДНК-дуплексами,
содержащими 0-этилзамещснные нирофосфатные межнуклеотидные группы 109
2.7. Взаимодействие ДНК-дуплексов, содержащих замещенную пирофосфатігую межнуклеотидную группу, с мутаитными формами Fpg. coli 119
2.8. Определение аминокислоты Fpg Е. coli, ковалентно связанной с фосфатной группой ДНК в положении, каталитически расщепляемом ферментом 124
2.9. Схема взаимодействия Fpg Е. coli с фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса в растворе 132
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 141
3.1. Реактивы и материалы 141
3.1.1. Реактивы 141
3.1.2. Среды для культивирования клеток 141
3.1.3. Буферные растворы 142
3.1.4. Олигодезоксирибонуклеотиды 142
3.1.4.1. Модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды 142
3.1.4.2. Анализ синтезированных олигонуклеотидов 142
3.1.5. Ферменты 143
3.2. Методы 143
3.2.1. Электрофорез в полиакриамидном геле в денатурирующих условиях 143
3.2.2. Электрофорез в полиакриамидном геле в неденатурирующихусловиях 144
3.2.3. Электрофорез в SDS-полиакриламидном геле 144
3.2.4. Радиоавтография 144
3.3. Общие методики 145
3.3.1. Экспрессия FpgE.coli и hOggl 145
3.3.2. Выделение Fpg Е. coli 145
3.3.3. Выделение hOggl 146
3.3.4. 5-[ Р]-Фосфорилирование олигонуклеотидов 146
3.3.5. Синтез этиловых эфиров олигонуклеотидов 147
3.3.6. Синтез модифицированных ДНК-дуплексов методом химического mлигирования 147
3.3.7. Получение модифицированного ДНК-дуплекса, содержащего АР-участок 147
3.3.8. Аминолиз и гидролиз ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные межнуклеотидные группы 148
3.3.9. Специфическое связывание модифицированных ДНК-дуплексов с
FpgE. сой, hOggl и мутантними формами Fpg Е. coli 148
3.3.10. Каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов
Fpg Е. coli и hOggl 148
3.3.11. Расщепление межнуклеотидной фосфодиэфирной связи в ДНК-дуплексах, содержащих АР-участки , , 148
3.3.12. Ковалентное связывание реакциоиноспособпых аналогов субстратов с
FpgE. coli 149
3.3.13. Нротеолиз ковалентного комплекса ДНК-дуплекса IV с Fpg Е. coli 149
3.3.14. Выделение олигоиуклеотидо-пептидного копьюгата и расщепление ковалентной связи между олигонуклеотиднъш и пептидным фрагментами коныогата 149
3.3.15. Масс-спектрометрия 150
3.3.16. Компьютерное моделирование 150
ВЫВОДЫ 151
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 152
ПРИЛОЖЕНИЕ 175
