Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Ретровирусные векторы как эффективная система переноса чужеродных генов в клетки эукариот 10
1.1.1. Биологические особенности ретровирусов 10
1.1.2. Создание ретровирусных векторов 13
1.1.3. Пакующие линии клеток 15
1.1.4. Свойства ретровирусных векторных систем и их использование для переноса чужеродной ДНК 19
1.2. Трансгенные животные биореакторы 20
1.2.1. Преимущества использование трансгенных животных для
производства рекомбинантных белков 20
1.2.2 Продукция рекомбинантных белков в молоко трансгенных животных 24
1.2.3. Использование ретровирусных векторов для получения трансгенных животных биореакторов 25
1.3. Получение трансгенной сельскохозяйственной птицы 26
1.3.1. Использование вирусных векторов для переноса экзогенной ДНК в эмбриональные клетки птицы 29
1.3.2. Микроинъекция ДНК в цитоплазму зиготы 33
1.3.3. Использование эмбриональных стволовых клеток 34
1.3.4. Использование примордиальных зародышевых клеток 35
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39
2.1. Реактивы и оборудование 39
2.2. Используемые генные конструкции и пакующие линии клеток 42
2.3. Культивирование клеток 44
2.4. Получение первичной культуры клеток-мишеней 45
2.4.1. Получение первичной культуры клеток молочной железы... 45
2.4.2 Получение первичной культуры клеток эмбриона курицы... 45
2.5 Трансформация клеток-мишеней in vitro 46
2.5.1. Совместное культивирование с клетками-«упаковщицами»... 46
2.5.2. Инфицирование культуральной жидкостью, содержащей рекомбинантный ретровирус 47
2.6. Введение генных конструкций в клетки-мишени in vivo 47
2.6.1. Введение генных конструкций в молочную железу сельскохозяйственных животных 47
2.6.2. Введение генных конструкций в эмбрионы кур 48
2.7. Анализ на наличие генной конструкции (ГЩР) 48
2.8 Анализ экспрессии рекомбинантных белков 49
2.8.1. Иммуноферментный анализ (ИФА) 49
2.8.2. Иммуногистохимия 50
2.9. Получение и приготовление препаратов митотических хромосом кур 50
3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 52
3.1 Трансформация клеток молочной железы сельскохозяйственных животных 52
3.1.1. Трансфекция клеток молочной железы сельскохозяйственных животных in vitro 52
3.1.2. Введение экзогенной ДНК в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных in vivo 53
3.1.3. Иммуногистохимический анализ экспрессии рекомбинантного ЭПО в молочной железе опытных животных 61
3.1.4. Факторы, влияющие на эффективность трансформации клеток молочной железы in vivo 64
3.2. Трансформация клеток эмбрионов кур 66
3.2.1. Трансфекция эмбриональных клеток кур in vitro 66
3.2.2. Введение генных конструкций в эмбрионы кур in vivo 68
3.2.2.1 Трансформация клеток эмбрионов кур культуральной жидкостью 69
3.2.2.2 Трансформация клеток эмбрионов кур суспензией клеток-«упаковщиц» 75
3.2.3. Влияние различных факторов на эффективность трансформации клеток эмбрионов кур 79
3.3. Сравнительный анализ эффективности использования пакующих линий клеток AMI2 npgl3 для трансформации клеток-мишеней in vitro и in vivo 82
4 ОБСУЖДЕНИЕ 85
5 ВЫВОДЫ 93
6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 95
ЛИТЕРАТУРА
