Введение
Глава 1. Литературный обзор 18
1.1. Особенности формирования иммунного ответа к мироорганизмам F. tularensis
1.1.1. Особенности неспецифического иммунного ответа к бактериям F. tularensis 18
1.1.2. Гуморальное звено в формировании противотуляремийного иммунитета 26
1.1.3. Клеточное звено в формировании противотуляремийного иммунитета 28
1.1.4. Моделирование инфекционного и вакцинного процессов туляремии 31
1.1.5. Оценка напряженности противотуляремийного иммунитета 32
1.1.6. Современные методы оценки противотуляремийного иммунитета 36
1.2. Иммунологические аспекты чумы 39
1.2.1. Иммунопатогенез чумы 39
1.2.2. Особенности неспецифического иммунного ответа при чуме 42
1.2.3. Особенности формирования адаптивного иммунного ответа против Y. pestis 48
1.2.4. Современное состояние иммунопрофилактики чумы 51
1.2.5. Поиск маркеров, отражающих наличие протективого противочумногоиммунитета 52
Глава 2. Материалы и методы 56
2.1. Штаммы 56
2.2. Среды и условия культивирования 56
2.3. Антигены микроорганизмов 56
2.4. Лабораторные животные 57
2.5. Схемы иммунизации животных 58
2.6. Выделение иммунокомпетентных клеток 59
2.6.1. Получение спленоцитов 59
2.6.2. Выделение лимфоцитарной массы на градиенте плотности
2.7. Стимуляция лимфоцитов 60
2.8. Цитометрический анализ 61
2.8.1. Окрашивание поверхностных маркеров 61
2.8.2. Окрашивание внутриклеточных цитокинов 61
2.8.3. Цитометрический анализ экспрессии поверхностных маркеров и синтеза цитокинов 61
2.8.4. Определение пролиферативной активности лимфоцитов методом цитофлюориметрии с использованием CFSE (карбоксифлуоресцеин сукцимидиловый эфир) красителя 63
2.8.5. СВА анализ 65
2.9. Определение титра антител к антигенам чумного микроба 65
2.10. Определение антител к антигенам F. tularensis 66
2.11. Определение напряженности иммунитета 66
2.12. Постановка реакции лейкоцитолиза с тулярином 67
2.13. Реакция бластгрансформации лимфоцитов (РБТЛ) 68
2.14. Статистический анализ 69
Глава 3. Оценка противотуляремийного клеточного и гуморального иммунитета у мышей линии balb/c после ммунизации препаратами против туляремии 70
3.1. Выявление антител к антигенам F. tularensis в сыворотке крови иммунизированных против туляремии мышей 72
3.2. Оценка перестройки поверхностных маркеров лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis 73
3.3. Оценка клеточного противотуляремийного иммунитета по активации синтеза ИФН-у, ФНО-а и ИЛ-17 в ответ на рестимуляцию лимфоцитов in vitro тулярином и KHKF. tularensis 15 НИИЭГ 78
3.4. Изменение активности синтеза ИФН-у и ФНО-а лимфоцитами под влиянием антигенов F. tularensis 80
3.5. Оценка специфичности тулярина 82
3.6. Оценка специфичности КНК F.tularensis 86 3.7. Разработка методов in vitro для оценки эффективности иммунологической перестройки у мышей, иммунизированных разными дозами F. tularensis 15 НИИЭГ 89
3.8. Оценка напряженности иммунитета к туляремии у мышей через разные сроки после иммунизации F. tularensis 15 НИИЭГ и показателями противотуляремийного иммунитета в системе in vitro 99
3.9. Выявление иммунологических маркеров, коррелирующих с защитой от заражения туляремией мышей, иммунизированных разными препаратами против туляремии 104
Обсуждение 108
Глава 4. Оценка клеточного и гуморального противотуляремийного иммунитета у людей, вакцинированных живой туляремийной вакциной 121
4.1. Оценка гуморального противотуляремийного иммунитета 121
4.1.1. Выявление антител к антигенам F.tularensis в сыворотке крови людей 121
4.1.2. Анализ изменений экспрессии маркеров в присутствии антигенов F. tularensis на поверхности В лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой туляремийной вакциной людей 122
4.1.2.1. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD69 рецепторной молекулы на поверхности В лимфоцитов 122
4.1.2.2. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD138 рецепторной молекулы на поверхности лимфоцитов и моноцитов 125
4.1.2.3. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD86 рецепторной молекулы на поверхности В лимфоцитов 126
4.2. Оценка результатов реакции лейкоцитолиза с тулярином 127
4.3. Сравнительная оценка изменений экспрессии поверхностных маркеров
Т лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой
туляремийной вакциной людей, под влиянием тулярина 129
4.3.1. Сравнительная оценка изменений активации и численности CD45RO+
субпопуляции Т лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis 129 4.3.2. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD69 и HLA-DR рецепторных молекул на поверхности субпопуляций Т лимфоцитов 132
4.3.3. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD107b и CD95 рецепторных молекул на поверхности субпопуляций Т-лимфоцитов 135
4.3.4. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD154, CD28 и CD25
рецептора на поверхности Т лимфоцитов 137
4.4. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов 138
4.4.1. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов в реакции
бласттрансформации 138
4.4.1. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов методом цитометрии. 139
4.5. Оценка эффекторной активности лимфоцитов 139
4.5.1. Оценка синтеза цитокинов лейкоцитами крови людей, иммунизированных живой туляремийной вакциной, в ответ на стимуляцию клеток антигенами F. tularensis в реакциях in vitro 139
4.5.2. Уровень синтеза ИФН-у и ФНО-а Т лимфоцитами крови людей, иммунизированных живой туляремийной вакциной, в ответ на стимуляцию клеток антигенами F. tularensis в реакциях in vitro 140
Обсуждение 142
Глава 5. Оценка клеточного и гуморального иммунитета у мышей линии balb/c после иммунизации коммерческой живой или экспериментальными чумными вакцинами 152
5.1. Изменение экспрессии TLR-2 и TLR-9 рецепторов на поверхности Т-лимфоцитов под влиянием антигенов F1 и V 154
5.2. Оценка перестройки маркера ранней активации CD69 на поверхности лимфоцитов под влиянием антигенов Y. pestis 157
5.3. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов мышей в ответ на активацию клеток антигенами чумного микроба 159
5.4. Изменение активности синтеза ИФН-у, ФНО-а и ИЛ-4 лимфоцитами под влиянием антигенов Y. pestis 162 5.5. Изменение цитокиновой активности спленоцитов под влиянием антигенов Y. pestis 163
5.6. Изменения экспрессии ко-стимулирующих молекул CD28 и CD154 на поверхности Т лимфоцитов под влиянием антигенов F1 и V 166
5.7. Изменение экспрессии CD69 и CD86 рецепторов на поверхности CD 19+ CD22+ В лимфоцитов под влиянием антигенов F1 и V 167
5.8. Выявление антител к F1 и V антигенам Y. pestis в сыворотках крови иммунизированных мышей 168
5.9. Выявление корреляций между напряженностью иммунитета к чуме у мышей и изменением экспрессии поверхностных маркеров и синтеза цитокинов под
влиянием антигенов чумного микроба в системе in vitro 170
Обсуждение 173
Глава 6. Оценка иммунного ответа у людей после иммунизации живой чумной вакциной 184
6.1. Выявление антител в сыворотках крови доноров к антигенам Y. pestis 186
6.2. Изменение экспрессии рецепторных молекул в присутствии антигенов Y. pestis на поверхности В лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой чумной вакциной людей, под влиянием антигенов чумного микроба 188
6.2.1. Изменение экспрессии CD69 рецепторной молекулы на поверхности В-лимфоцитов 188
6.2.2. Изменение экспрессии CD138 рецепторной молекулы на поверхности В лимфоцитов 190
6.2.3. Изменение экспрессии CD86 и CD80 рецепторных молекул на поверхности В-лимфоцитов 191
6.3. Изменение экспрессии поверхностных маркеров Т лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой чумной вакциной людей, под влиянием антигенов Y. pestis 193
6.3.1. Изменение экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т-лимфоцитов 193 6.3.2. Изменение экспрессии CD95 рецептора на поверхности субпопуляций Т лимфоцитов 195
6.3.3. Изменение экспрессии CD107b рецептора на поверхности субпопуляций Т лимфоцитов 197
6.3.4. Изменение экспрессии CD45RO рецептора на поверхности HLA-DR+ субпопуляции Т лимфоцитов 197
6.4. Изменение активности синтеза цитокинов иммунокомпетентными клетками, полученными от невакцинированных и иммунизированных живой чумной вакциной людей, под влиянием антигенов чумного микроба 201
6.4.1. Изменение активности синтеза цитокинов ИФН-у и ФНО-а субпопуляциями Т лимфоцитов под влиянием антигенов чумного микроба 201
6.4.2. Изменение активности синтеза цитокинов иммунокомпетеными клетками крови под влиянием антигенов чумного микроба 203
Обсуждение 205
Глава 7. Оценка специфического клеточного иммунного ответа после иммунизации против сибирской язвы 213
Глава 8. Оценка иммунного статуса людей постоянно прививающихся против особо опасных инфекций 219
Выводы 221
Заключение 224
Перечень сокращений, условных обозначений, символов,
Единиц и терминов 226
Список литературы
