Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1 Общая характеристика динофлагеллят 15
1.1.1 Морфологические и физиологические особенности 15
1.1.2 Филогенетическое положение и классификация 16
1.1.3 Ядерный аппарат и организация генома 18
1.1.4 Жизненный цикл и размножение 23
1.1.5 Покровы динофлагеллят и их реорганизация в ходе жизненного цикла 24
1.1.6 Экология и токсикология 31
1.1.7 Краткая характеристика модельного объекта – Prorocentrum minimum (Pavillard) Schiller 1933 33
1.2 Ионные каналы 36
1.2.1 Общие сведения 36
1.2.2 Суперсемейство потенциал-управляемых катионных каналов 40
1.2.3 Эволюция четырехдоменных потенциал-управляемых катионных каналов 44
1.2.4 Метод локальной фиксации потенциала на мембране 52
1.3 Ионные каналы динофлагеллят 56
ГЛАВА 2. Материалы и методы 60
2.1 Культура динофлагеллят P. minimum 60
2.2 Биоинформатический анализ данных 60
2.2.1 Нуклеотидные и аминокислотные базы данных и поиск гомологов потенциал-управляемых катионных каналов 60
2.2.2 Выравнивание аминокислотных последовательностей 61
2.2.3 Оценка идентичности гомологичных последовательностей 62
2.2.4 Филогенетический анализ четырехдоменных потенциал управляемых катионных каналов 62
2.2.5 Предсказание вторичных структур участков четырехдоменных потенциал-управляемых катионных каналов 65
2.3 Получение и исследование сферопластов P. minimum 65
2.3.1 Индукция экдизиса 65
2.3.2 Получение сферопластов 65
2.3.3 Подсчет нативных и экдизировавших клеток и сферопластов 66
2.3.4 Микроскопия и анализ изображений 66
2.4 Электрофизиологичесикие исследования 67
2.4.1 Использованная аппаратура и программы 67
2.4.2 Условия регистрации трансмембранного тока 67
ГЛАВА 3. Результаты 69
3.1 Идентификация представителей суперсемейства потенциал управляемых катионных каналов в транскриптомах динофлагеллят 69
3.1.1 Калиевые каналы 70
3.1.2 Каналы, управляемые циклическими нуклеотидами 72
3.1.3 Удвоенные последовательности каналов Kv и HCN/CNG 74
3.1.4 Каналы TRP 77
3.1.5 Каналы TPC 78
3.1.6 Потенциал-управляемые протонные каналы 79
3.1.7 Четырехдоменные потенциал-управляемые катионные каналы 79
3.2 Филогенетический анализ четырехдоменных потенциал-управляемых
катионных каналов динофлагеллят 80
3.2.1 Филогенетическое разнообразие потенциал-управляемых
катионных каналов динофлагеллят в пределах супергруппы SAR 80
3.2.2 Филогенетическое разнообразие четырехдоменных потенциал управляемых катионных каналов динофлагеллят в пределах домена Eukaryota
3.3 Анализ структуры функционально значимых участков
аминокислотных последовательностей четырехдоменных потенциал управляемых катионных каналов динофлагеллят 93
3.3.1 Структура селективного фильтра 94
3.3.2 Структура сегментов S4 97
3.3.3 Первичная и вторичная структура области инактивационных ворот 100
3.4 Регистрация активности ионных каналов динофлагеллят 108
3.4.1 Разработка подхода к применению метода локальной фиксации потенциала на мембране для изучения ионных каналов динофлагеллят 108
3.4.2 Максимальный выход ДХБ-индуцированных сферопластов 112
3.4.3 ДХБ-индуцированный экдизис клеток P. minimum 113
3.4.4 Сравнение экдизировавших клеток и ДХБ-индуцированных сферопластов 114
3.4.5 Регистрация активности ионных каналов плазматической мембраны ДХБ-индуцированных сферопластов P. minimum 115
ГЛАВА 4. Обсуждение 123
4.1 Суперсемейство потенциал-управляемых катионных каналов динофлагеллят 123
4.1.1 Калиевые каналы Kir, Kv, KCa и K2P 124
4.1.2 Каналы TRP, EAG и HCN/CNG 125
4.1.3 Удвоенные последовательности Kv и HCN/CNG 126
4.1.4 Каналы TPC 127
4.1.5 Каналы Hv 128
4.2 Четырехдоменные потенциал-управляемые катионные каналы (ЧД ПКК) динофлагеллят 129
4.2.1 Филогенетическое разнообразие ЧД ПКК 129
4.2.2 Структурно-функциональное разнообразие ЧД ПКК
4.2.2.1 Селективный фильтр 132
4.2.2.2 Структура сегментов S4 134
4.2.2.3 Первичная и вторичная структура области инактивационных ворот 136
4.2.3 Возможная функциональная роль ЧД ПКК динофлагеллят 139
4.3 Образование сферопластов армированных динофлагеллят P. minimum 140
4.4 Трансмембранные ионные токи P. minimum 144
Заключение 146
Выводы 148
Список литературы
