Введение
1. Обзор литературы 13
1.1 Основные понятия биологии стволовых клеток 13
1.1.1 Основные этапы в истории открытия и изучения стволовых клеток 13
1.1.2 Определение, свойства и классификация стволовых клеток 14
1.1.3 Идентификация стволовых клеток 19
1.1.4 Мезенхимные стволовые клетки из десквамированного эндометрия 20
1.2 Стволовые клетки и стресс 22
1.2.1 Окислительный стресс и стволовые клетки человека 22
1.2.2 Различные реакции эмбриональных и мезенхимных стволовых клеток человека на стресс 23
1.3 Апоптоз 24
1.3.1 Основные маркеры апоптоза 24
1.3.2 Внутриклеточная машинерия апоптоза 25
1.4 Феномен старения клеток 27
1.4.1 Репликативная и стресс-индуцированная формы клеточного старения 27
1.4.2 Укорочение теломер, как одна из причин развития старения 28
1.5 Механизмы, лежащие в основе клеточного старения 29
1.5.1 Инициация клеточного старения в ответ на повреждение ДНК 29
1.5.2 Активация DDR приводит к индукции блока клеточного цикла 31
1.5.3 Для установления и развития старения необходима постоянная активация DDR 33
1.5.4 Роль АФК в развитии клеточного старения 34
1.5.5 Митохондрии – основной источник эндогенных АФК 36
1.5.6 Вклад митохондрий в развитие клеточного старения
1.5.7 Участие ферментов антиоксидантной защиты в клеточном старении 38
1.5.8 р38 МАРК играет важную роль как в репликативном, так и в стресс-индуцированном старении клеток 39
2. Материалы и методы исследований 42
2.1 Клеточные линии и особенности их культивирования 42
2.2 Моделирование окислительного стресса и условия обработки клеток 42
2.3 Оценка жизнеспособности методом МТТ 43
2.4 Метод проточной цитофлуориметрии 43
2.4.1. Анализ апоптотических клеток, окрашенных с помощью йодида пропидия и конъюгата Annexin V/FITC 43
2.4.2. Анализ распределения по фазам клеточного цикла, выживаемости и размера клеток с помощью метода проточной цитометрии 44
2.4.3. Измерение уровня внутриклеточных АФК и митохондриальных пероксидов, совокупной митохондриальной массы и мембранного потенциала митохондрий (ММП) 44
2.5 Использование конфокальной микроскопии для оценки внутриклеточных АФК, клеточных пероксидов, ММП и митохондриальной массы 45
2.6 Электрофорез и иммуноблотинг 45
2.6.1. Приготовление проб для электрофоретического разделения 45
2.6.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 45
2.6.3. Иммуноблотинг со специфическими антителами 46
2.7 Анализ экспрессии генов 47
2.8 Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток 48
2.9 Выявление активности SA--Gal 49
2.10 Использованные реактивы, ингибиторы и антиоксиданты 49
2.11 Статистическая обработка данных 49
3. Результаты 51
3.1. Оценка устойчивости различных типов клеток к окислительному стрессу 51
3.2. Исследование характера гибели ЭСК, фибробластов и эМСК при окислительном стрессе 3.2.1. Н2О2-индуцированный апоптоз ЭСК 53
3.2.2. Гибель фибробластов при окислительном стрессе 55
3.2.3. Характер ответа эМСК на разные дозы Н2О2 56
3.3. Исследование ответа фибробластов на действие Н2О2 в сублетальной концентрации 59
3.3.1. Индукция преждевременного старения фибробластов после обработки 200 мкМ Н2О2
3.4. Преждевременное старение эМСК в ответ на действие Н2О2 в сублетальной концентрации 61
3.4.1. Развитие фенотипа преждевременного старения в Н2О2-обработанных эМСК 61
3.4.2. Остановка пролиферации и арест клеточного цикла в Н2О2-обработанных эМСК 63
3.4.3. Реализация блока клеточного цикла в Н2О2-обработанных эМСК 66
3.5. Исследование механизма, лежащего в основе стресс-индуцированного старения эМСК. 68
3.5.1. Быстрое накопление экзогенной Н2О2 в эМСК 68
3.5.2. Ранняя активация ответа на повреждение ДНК вследствие проникновения Н2О2 в эМСК 69
3.5.3. Активация МАР-киназных путей в эМСК в условиях окислительного стресса 73
3.5.4. Развитие Н2О2-индуцированного старения эМСК опосредовано повышением уровня эндогенных АФК вследствие роста митохондриальной активности 74
3.5.5. Повышение уровня эндогенных АФК приводит к продолжительной активации DDR в процессе развития Н2О2-индуцированного старения эМСК 79
3.6. Пути предотвращения преждевременного старения эМСК в условиях окислительного
стресса 82
3.6.1. Использование различных антиоксидантов для предотвращения индуцированного преждевременного старения эМСК 82
3.6.2. Ингибирование МАР-киназы р38 частично предотвращает развитие Н2О2-индуцированного старения эМСК 90
4. Обсуждение 99
Заключение 113
Выводы 114
Список цитируемой литературы 115
