Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1 Стволовые клетки 13
1.2 Региональные стволовые клетки 14
1.3 Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) 18
1.4 ЭСК сельскохозяйственных животных 26
1.5 Использование фидерных слоев для длительного культивирования эмбрионов сельскохозяйственных животных in vitro 31
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36
2.1 Приборы и оборудование 39
2.2 Культуральная посуда 41
2.3 Питательные среды и растворы 41
2.4 Культуры клеток 44
2.5 методы Культивирования клеток 45
2.5.1 Приготовление фидерных слоев из перевиваемых эмбриональных фибробластов мыши линии STO 45
2.5.2 Приготовление фидерных слоев, представленных первичными клетками Сертоли свиньи 47
2.5.3 Приготовление фидерных слоев из перевиваемой клеточной линии тестикул поросенка (ПТП) 47
2.5.4 Пригототовление фидерных слоев из клеток СПЭВ 48
2.5.5 Приготовление фидерных слоев из клеток FBT 48
2.5.6 Приготовление фидерных слоев клеток ЗТЗ Balb\C 48
2.5.7 Приготовление фидерных слоев из клеток NTH ЗТЗ 48
2.5.8 Культивирование клеток BRL 48
2.5.9 Приготовление фидерных слоев, представленных клетками RUF 48
2.5.10 Культивирование первичных эмбриональных фибробластов мыши и кролика для приготовления фидерных слоев 49
2.5.10.1 Получение первичной культуры эмбриональных фибробластов 49
2.5.10.2 Культивирование первичных эмбриональных фибробластов мыши и кролика (МЭФ и КЭФ) 49
2.6 Техника получения преимплантационных эмбрионов свиньи и кролика 49
2.7 Получение эмбрионов кролика на стадии гаструляции 50
2.8 Оценка качества преимплантационных эмбрионов 50
2.9 Оценка качества эмбрионов на стадии гаструляции 51
2.10 Оценка колоний ЭС-подобных клеток 51
2.11 Приготовление кондиционированных сред 51
2.12 Желатинизирование пластиковой посуды 51
2.13 Силиконизирование посуды 52
2.14 Уравновешивание парафинового масла со средой 52
2.15 Определение жизнеспособности клеток 52
2.16 Подсчет посевной концентрации клеток 53
2.17 Подсчет итоговой концентрации клеток 53
2.18 Подсчет индекса пролиферации 53
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 55
3.1 Получение клеток свиньи с ЭС-подобной морфологией 55
3.1.1 Характеристика биологического материала 55
3.1.2 Влияние стадии эмбриогенеза и фидерных слоев клеток на получение колоний ЭС-подобных клеток свиньи 59
3.1.3 Характеристика ЭС-подобных клеток свиньи 65
3.2 Получение из бластоцист кролика клеток с фенотипом, подобным эски их характеристика 66
3.2.1 Длительное культивирование преимплантационных эмбрионов кролика in vitro на фидерных слоях 67
3.2.2 Влияние некоторых ростовых факторов на эффективность получения 3
клеток кролика с ЭС-подобной морфологией из длительно культивируемых бластоцист 72
3.2.3 ВыделениеЭС-подобных клеток из бластоцист кролика 74
3.2.4 Влияние продолжительного культивирования бластоцист на получение ЭС-подобных клеток кролика 76
3.2.5 Культурально-морфологическая характеристика ЭС-подобных клеток кролика в культуре 77
3.3 Получение от эмбрионов на стадии гаструляции ППЗ-подобных клеток кролика и их характеристика 80
3.3.1 Сравнение способов получения ППЗ-подобных клеток кролика 81
3.3.2 Характеристика первичных культур клеток кролика, выделенных из гаструл 83
4 ОБСУЖДЕНИЕ 90
5 ВЫВОДЫ 98
6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 100
7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 101
