Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Семейство раково-тестикулярных антигенов 10
1.2. Применение РТА в терапии лейкозов 12
1.3. Ген PRAME. Значение в терапии опухолей 16
1.3.1. Ген PRAME – ингибитор сигналов ретиноевой кислоты 16
1.3.2. Белок PRAME играет роль в регуляции TRAIL в опухолевых клетках 16
1.3.3. Белок PRAME является частью Cul2 Е3 убиквинтинлигазного комплекса 18
1.3.4. Значение гена PRAME в апоптозе 19
1.3.5. Регуляция гена PRAME в клетке 21
1.3.6. Проблема локализации белка PRAME в опухолевой клетке 22
1.4. Ген PRAME – маркер диагностики опухолей человека 23
1.4.1. Ген PRAME– маркер диагностики меланомы 23
1.4.2. Ген PRAMEв дифференциальной диагностике солидных опухолей 25
1.5. Применение белкаPRAME в терапии опухолей человека 26
1.5.1. Вакцина, направленная на два антигена:PRAMEи PSMA 26
1.5.2. Вакцина на основе PRAME при немелкоклеточном раке легкого 28
1.5.3. Вакцина на основе PRAME при меланоме 29
1.6. Дендритные клетки (ДК) и их значение в обеспечении противоопухолевой защиты организма 31
1.6.1. Биология дендритных клеток. 31
1.6.2. Цитотоксическое действие ДК и их значение в обеспечении 37
противоопухолевого иммунитета 37
1.7. Заключение 42
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Материалы и оборудование 44
2.1.1. Реактивы 44
2.1.2. Клеточные линии 45
2.1.3. Оборудование 45
2.2. Методы исследования 45
2.2.1. Культуральный метод 45
2.2.2. Трансфекция линий культивируемых клеток плазмидой, содержащей ген PRAME 46
2.2.3. Выделение лимфоцитов (ЛФ) на среде Lymphoseparation medium по градиенту плотности из КМ 46
2.2.4. Приготовление препаратов из клеток костного мозгадля иммуногистохимического окрашивания 47
2.2.4.1. Работа с живыми клетками в лунках с полилизином на предметных стеклах 47
2.2.4.2. Приготовление фиксированных препаратов на предметном стекле (без полилизина) 48
2.2.4.3. Приготовление фиксированных препаратов из КМ в лунках с полилизином на предметном стекле 49
2.2.5 МТТ тест 50
2.3. Метод анализа ДНК микрочипов 51
2.4. Получение дендритных клеток 53
2.4.1. "Нагрузка" ДК 53
2.4.2. Терминальная дифференцировка ДК 54
2.4.3. Совместная инкубация ДК с опухолевыми или нормальными клетками 54
2.5. Выделение РНК и ПЦР в реальном времени 54
Глава 3. Результаты исследований 56
3.1. Результаты трансфекции линий B16F10 и WI-38 плазмидой, содержащей ген PRAME 56
3.2. Локализациябелка PRAME 56
3.2.1. Локализация белка PRAME в опухолевых линиях 56
3.2.2. Распределение белка PRAME в клетках костного мозга больных острым лейкозом 63
3.3. Подавление роста PRAME-экспрессирующих опухолевых клеток при инкубации их с моноклональных антителами к белку PRAME 67
3.3.1. Воздействие моноклональных антител на линию B16F10PRAME 67
3.3.2. Цитостатическое действие МКА к PRAME на опухолевые клетки 68
3.4. Исследование влияния экспрессии гена PRAME на транскрипционный профиль WI-38 PRAME 72
3.5. Сохранение цитотоксической активности дендритных клеток после нагрузки рекомбинантным белком PRAME 73
Глава 4. Обсуждение результатов 83
4.1. Оценка особенностей локализации белка PRAME в опухолевых клетках 83
4.2. Изучение цитостатического эффекта моноклональных антител к белку PRAME на рост опухолевых клеток 85
4.3. Изменение уровня экспрессии генов в линии клетокWI-38 после трансфекции онкогена PRAME 87
4.4. Оценка нагрузки рекомбинантным белком PRAMEдендритных клеток на их цитотоксическоедействие 92
Заключение 95
Выводы 97
Список использованных сокращений 98
Список литературы 101
