Введение
1. Аспарагиназа как противолейкозный препарат (обзор литературы) 10
1.1. Бактериальные аспарагиназы и история их изучения 10
1.2. Структурно-функциональные особенности аспарагиназы 15
1.3. Физико-химические свойства 24
1.4. Гидролиз аспарагина определяет противоопухолевое действие аспарагиназы 27
1.5. Глутаминазная активность - основная причина токсичности аспарагиназы 30
1.6. Современные терапевтические аспарагиназы 32
1.7. Актуальность разработки лекарственного препарата на основе аспарагиназы без глутаминазной активности 34
2. Материалы и методы 37
2.1. Генно-инженерные методы клонирования и экспрессии 38
2.2. Выделение рекомбинантного фермента методом колоночной хроматографии 42
2.3. Физико-химическая характеристика аспарагиназы 44
2.3.1 .Электрофорез в полиакриламидном геле 44
2.3.2. Изоэлектрофокусирование 44
2.3.3. Определение аспарагиназной активности 44
2.3.4.Опре деление концентрации белка. 45
2.3.5.0пределение температуры денатурации фермента 46
2.3.6.Определение стабильности фермента в растворе мочевины 46
2.3.7.0пределение стабильности фермента при многократных циклах замораживания - оттаивания 46
2.4. Определение равновесных кинетических констант 47
2.5. Определение цитотоксической активности аспарагиназы 47
2.6. Определение перекрестной иммуноспецифичности аспарагиназ 49
2.6.1. Получение специфических поликлональных антител 49
2.6.2. Определение уровня выработки антител методом прямого иммуноферментного анализа (ИФА) 50
3. Результаты и обсуждение 52
3.1 Получение рекомбинантного штамма-продуцента НрА 52
3.1.1. Клонирование гена НрА 52
3.1.2. Оптимизация генетической конструкции для экспрессии НрА в клетках E.coli 61
3.1.3. Характеристика рекомбинантного штамма продуцента 63
3.1.4. Экспрессия рекомбинантной НрА 64
3.2. Выделение аспарагиназы НрА 64
3.3. Характеристика рекомбинантной НрА 69
3.3.1. Физико-химические свойства 69
3.3.2. Каталитические свойства 74
3.3.3. Цитотоксическая активность 82
3.3.4. Перектестная антигенность НрА и ЕсА 85 3.4. Возможности практического применения НрА 87
Выводы 91
Приложение 1 92
Список литературы 95
