Введение
1. Обзор литературы 6
1.АФК 6
1.1 .Источники возникновения АФК 7
1.2. Последствия действия АФК 7
2. Антиоксиданти 9
2.1. Супероксиддисмутазы (SOD) 10
2.2. Каталаза 11
2.3. Глутатионпероксидазы (GPx) 13
2.4. Пероксиредоксины (Ргх) 15
2.4.1. Открытие пероксиредоксинов. Эволюция Ргх и их классификация 15
2.4.2. Каталитический цикл Ргх 15
2.4.3. Структура Ргх 17
2.4.4. Регуляции активности Ргх 21
2.4.5. Ргх из различных организмов 25
Ргх прокариот 25
Ргх архебактерий 26
Ргхэукариот 26
2.4.6. Ргх человека 31
Prxl 31
Ргх2 33
РгхЗ 33
Ргх4 34
Ргх5 36
Ргхб 37
2.4.7.Возможное применение Ргх в медицине 45
II. Материалы и методы 47
1. Материалы 47
2. Методы 48
2.1. Выделение РНК 48
2.2. Определение чистоты и концентрации нуклеиновых кислот 49
2.3. ОТПЦР 50
2.4. Мутагенез Ргхб человека 51
2.5. Электрофорез ДНК 52
2.6. Сравнение уровня экспрессииргхбХ. laevis на разных стадиях развития 52
2.7. Клонирование и экспрессия генов ргхб 53
2.8. Выделение и очистка белков Ргхб 53
2.9. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 54
2.10. Иммунноблоттинг 55
2.11. Определение активности SOD слитой конструкции Mn-SOD-Ргхб 55
2.12. Определение антиоксидантной активности 56
2.13. Определение пероксидазной активности 56
2.14. Определение констант Михаэлиса 56
2.15. Определение оптимума рН и температуры 56
2.16. Определение фосфолипазной активности 57
2.17. Определение термостабильности 57
2.18. Исследование структуры Ргхб 58
2.19. In silico методы 58
III. Результаты исследований и их обсуждение 59
1. Получение генов ргхб 59
2. Экспрессия генов ргхб 59
3. Получение ферментов Ргхб 62
4. Антиоксидантная активность Ргхб 64
5. Пероксидазная активность Ргхб 64
6. Субстратная специфичность Ргхб 66
7. Оптимум рН и температуры пероксидазной реакции 67
8. Фосфолипазная активность Ргхб 68
9. Термостабильность Ргхб 71
10. Структура Ргхб 74
11. Перспективы применения Ргхб в медицине 81
Заключение 85
Выводы 86
Публикации по теме диссертации 87
Список цитируемой литературы 88
Приложение 108
