Введение
ГЛАВА 1. Устойчивость микроорганизмов к карбапенемам 9
1.1. Карбапенемы 9
1.2. Основные механизмы устойчивости микроорганизмов к карбапенемам 13
1.3. Классификация бета-лактамаз 15
1.4. Карбапенемазы различных молекулярных классов
1.4.1. Карбапенемазы молекулярного класса А 19
1.4.2. Карбапенемазы молекулярного класса В 22
1.4.3. Карбапенемазы молекулярного класса D 28
ГЛАВА 2. Методы определения устойчивости бактерий к карбапенемам и типирования карбапенемаз 32
2.1. Фенотипические методы определения устойчивости к карбапенемам 32
2.1.1. Определение антибиотикочувствительности бактерий по значению минимально подавляющей концентрации 32
2.1.2. Скрининговые методы выявления карбапенемаз 34
2.1.3. Биохимические и аналитические методы детекции продукции карбапенемаз 38
2.2. Генотипические методы идентификации карбапенемаз 45
2.2.1. Методы детекции карбапенемаз, основанные на амплификации ДНК 45
2.2.2. Секвенирование генов карбапенемаз 48
ГЛАВА 3. Гибридизационный анализ на ДНК-микрочипах 50
3.1. Гибридизационный анализ с использованием меченой ДНК-мишени 51
3.2. Гибридизационный анализ с использованием «сэндвич» схемы и немеченой ДНК-Эксперимент альнал часть 60
Глава 4. Материалы и методы исследования 60
4.2. Методы исследований 61
Результаты и обсуждение 69
Глава 5. Анализ последовательностей карбапенемаз и их кодирующих генов 69
5.1. Сбор и выравнивание кодирующих последовательностей генов карбапенемаз 69
5.2. Деление карбапенемаз на подгруппы 70
ГЛАВА 6. Амплификация генов карбапенемаз методом полимеразной цепной реакции 72
6.1. Выбор праймеров 72
6.2. Оптимизация условий ПНР
6.2.1. Оптимизация концентрации дезоксирибонуклеотидтрифосфатов 74
6.2.2. Оптимизация концентрации ионов магния 75
6.2.3. Оптимизация температуры отжига праймеров 6.3. Мультиплексная ПНР для одновременной амплификации генов восьми типов карбапенемаз в одной реакции 76
6.4. Введение биотина в качестве метки в гены амплифицируемых карбапенемаз в процессе мультиплексной ПНР 82
ГЛАВА 7. Молекулярный дизайн олигонуклеотидных зондов для идентификации генов карбапенемаз 84
7.1. Принцип проведения молекулярного дизайна олигонуклеотидных зондов и их 7.2. Подбор оптимальной длины спейсера олигонуклеотидных зондов 85
7.4. Выбор последовательностей «улавливающих» и «детектирующих» зондов для определения немеченой ДНК 93
7.4.1. Влияние взаимного расположения «улавливающего» и «детектирующего» олигонуклеотидных зондов 95
7.4.2. Зависимость эффективности гибридизационного анализа от типа «улавливаемой» цепи (прямая или обратная) 101
7.4.3. Влияние положения «улавливающего» зонда на ДНК-мишени на специфичность и чувствительность определения генов 102
7.4.4.Влияние величины «свободного» участка ДНК-мишени на эффективность гибридизации 104
7.5 Разработка рекомендаций по проведению молекулярного дизайна олигонуклеотидных
зондов 107
ГЛАВА 8. Метод гибридизационного анализа для идентификации генов карбапенемаз с использованием меченой и немеченой днк-мишени ... 109
8.1. Оптимизация условий проведения гибридизации с использованием меченой ДНК
8.1.1. Выбор оптимальной температуры гибридизации 109
8.1.2. Выбор концентрации соли в гибридизационном буфере 0
8.1.3.Влияние фрагментации меченой ДНК на эффективность гибридизации 111
8.2. Оптимизация условий проведения сэндвич-гибридизации на олигонуклеотидных микрочипах 113
8.2.1. Оптимизация условий гибридизации двухцепочечной ДНК-мишени 113
8.2.2. Влияние ионов магния в гибридизационном буфере на эффективность гибридизации ДНК-мишени 114
8.2.3. Оптимизация времени проведения стадии гибридизации 114
8.3. Сравнение двух методов гибридизационного анализа - с использованием меченой и
немеченой ДНК-мишени для идентификации генов карбапенемаз на олигонуклеотидных
микрочипах 116
8.3.1. Исследование специфичности выявления генов карбапенемаз с использованием меченой и немеченой ДНК-мишени 116
8.3.2. Сравнение чувствительности идентификации генов карбапенемаз с использованием меченой и немеченой ДНК-мишени 117
ГЛАВА 9. Микрочип для идентификации генов карбапенемаз с использованием немеченой ДНК-мишени 119
9.1. Дизайн олигонуклеотидного микрочипа для проведения сэндвич-гибридизации для идентификации генов карбапенемаз 119
9.2. Тестирование контрольных штаммов-продуцентов карбапенемаз 120
ГЛАВА 10. Интегрированный днк-микрочип для диагностики карбапенемаз, бета-лактамаз расширенного спектра и ингибитор резистентных бет а-лактам a3 124
10.1. Дизайн интегрированного олигонуклеотидного микрочипа для определения карбапенемаз и бета-лактамаз молекулярного класса А 124
10.2. Тестирование образцов ДНК, выделенной из контрольных штаммов-продуцентов
10.3. Тестирование смесей генов карбапенемаз и бета-лактамаз молекулярного класса А 129
10.4. Влияние состава ДНК-мишени на специфичность гибридизационного анализа на олигонуклеотидных микрочипах 133
ГЛАВА 11. Анализ образцов днк, выделенной из клинических штаммов граммотрицательных микроорганизмов на олигонуклеотидных
11.1. Апробация олигонуклеотидных микрочипов для идентификации генов карбапенемаз 8
типов методом гибридизационного анализа с использованием немеченой ДНК-мишени 135
11.2. Апробация интегрированного олигонуклеотидного микрочипа для идентификации генов
карбапенемаз и бета-лактамаз молекулярного класса А с использованием меченой ДНК
Выводы 140
Список литературы
