Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1. Факторы, влияющие на уровень иммунной защиты в лёгких 17
1.1.1. Роль сурфактантного белка А в иммунной защите 17
1.1.2. Загрязнение воздушной среды и заболевания лёгких. Роль озона ... 27
1.1.3. Гендер и заболевания лёгких 29
Собственные исследования 32
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Питательные среды и реактивы 32
2.2. Бактериальные штаммы, использованные в работе 32
2.3. Животные для экспериментальной пневмонии 32
2.4. Методы исследования
2.4.1. Культивирование бактерий 33
2.4.2. Мечение бактерий красителем FITC 33
2.4.3. Проведение бронхоальвеолярного лаважа лёгких человека 34
2.4.4. Очистка белка SP-A из бронхоальвеолярного лаважа человека 34
2.4.5. Очистка рекомбинантных SP-А1 и SP-A2 вариантов человека 35
2.4.6. Создание мутантных вариантов SP-A методом сайтнаправленного мутагенеза 36
2.4.7. Обработка белка SP-A озоном in vitro и оценка уровня его окисления 38
2.4.8. Выделение крысиных альвеолярных макрофагов 38
2.4.9. Выделение человеческих альвеолярных макрофагов 39
2.4.10. Оценка фагоцитоза in vitro методом световой микроскопии 40
2.4.11. Оценка фагоцитоза in vitro методом проточной цитофлуориметрии 41
2.4.12. Оценка ингибирования гемагглютинирующей активности вирусов Influenza А препаратами SP-A 42
2.4.13. Проведение электрофореза (SDS-PAGE) и иммуноблоттинга 43
2.4.14. Продукция и очистка антител, специфичных к SP-A1 44
2.4.15. Детекция SP-A методом иммунофлуоресценции 44
2.4.16. Количественный анализ содержания SP-A1 в бронхоальвеолярном лаваже иммуноферментным методом (ELISA) 45
2.4.17. Ингалирование мышей озоном 46
2.4.18. Заражение мышей бактериями K. pneumoniae 46
2.4.19. Интегральный метод оценки иммунитета по уровню выживаемости мышей от пневмонии 47
2.4.20. Оценка уровня фагоцитоза в условиях in vivo 47
2.4.21. Оценка микробиологического показателя иммунорезистентности по уровню бактериальной колонизации лёгких и диссеминации бактерий K. pneumoniae 47
2.4.22. Анализ гистологических изменений 48
2.4.23. Определение содержания кортизола в плазме крови 49
2.4.24. Оценка влияния половых гормонов на уровень иммунной защиты при экспериментальной пневмонии 51
2.4.25. Анализ общего содержания белков, SP-A, уровня белкового окисления в бронхоальвеолярном лаваже самцов и самок мышей после их ингалирования озоном 54
2.4.26. Анализ количества нейтрофилов, общего содержания белков и уровня белкового окисления, содержания SP-A и уровня его окисления, содержания фосфолипидов, хемокина MIP-2 в
бронхоальвеолярном лаваже самцов и самок мышей после ингалирования их озоном и инфицирования бактериями K. pneumoniae 55
2.4.27. Исследование протеома бронхоальвеолярного лаважа у SP-A нокаут мышей 56
2.4.28. Методы статистической обработки данных 56
ГЛАВА 3. Сравнительный анализ профагоцитарной активности sp-a1 и sp-a2 вариантов человека в условиях in vitro 57
3.1. Исследование профагоцитарной активности рекомбинантных SP-A1 и SP-A2 вариантов 57
3.2. Анализ механизмов, отвечающих за различную профагоцитарную активность SP-A1 и SP-A2 вариантов 70
ГЛАВА 4. Оценка влияния озона на профагоцитарную активность белка sp-a и его sp-a1 и sp-a2 вариантов In vitro 74
4.1. Изучение влияния окисления человеческого SP-A на его способность повышать фагоцитоз в условиях in vitro 74
4.2. Анализ влияния окисления рекомбинантных человеческих SP-A1 и SP-A2 вариантов на их профагоцитарную активность 78
Глава 5. Получение антител, специфичных к sp-a1, и оценка влияния различных факторов на геноспецифический состав sp-a в лёгких человека 83
Глава 6. Изучение иммуномодулирующего влияния белка sp-a на уровень иммунной защиты при экспериментальной пневмонии в условиях окислительного стресса 89
6.1. Экспериментальная модель пневмонии в условиях оксидантной нагрузки 89
6.2. Анализ показателей антиинфекционной резистентности
мышей, лишённых гена SP-A, при экспериментальной пневмонии в условиях окислительного стресса 92
6.2.1. Оценка состояния иммунитета у SP-A (-/-) мышей по уровню их выживаемости от пневмонии: влияние ингаляции озона и половой принадлежности 92
6.2.2. Оценка уровня фагоцитоза бактерий K. pneumoniae альвеолярными макрофагами SP-A (-/-) мышей в условиях in vivo 96
6.2.3. Исследование бактериальной колонизации лёгких и диссеминации бактерий K. pneumoniae у мышей, лишённых гена сурфактантного белка А, при экспериментальной пневмонии 99
6.3. Анализ клеточного состава, общего содержания белка, SP-A, и уровня белкового окисления в бронхоальвеолярном лаваже мышей «дикого типа» после ингаляции озона 101
6.4. Исследование протеома бронхоальвеолярного лаважа у SP-A нокаут мышей 107
ГЛАВА 7. Оценка влияния половой принадлежности на уровень иммунной защиты при экспериментальной пневмонии в условиях оксидантной нагрузки 119
7.1. Определение содержания кортизола в плазме крови животных, зараженных бактериями K. pneumoniae 119
7.2. Изучение влияния ингаляции озона на различные показатели в бронхоальвеолярном лаваже лабораторных мышей при пневмонии 121
7.3. Оценка гистологических изменений в органах и тканях животных при экспериментальной пневмонии 127
7.3.1. Влияние ингаляции озона 128
7.3.2. Влияние половой принадлежности 137
7.4. Оценка влияния половых гормонов на уровень иммунной защиты у лабораторных мышей при пневмонии в эксперименте
7.4.1. Выживаемость гонадэктомированых мышей от пневмонии после ингалирования озоном 141
7.4.2. Выживаемость гонадэктомированных и имплантированных препаратами половых гормонов мышей от пневмонии после ингалирования озоном 142
Глава 8. Экспериментальная модель, описывающая общие и гендерспецифические факторы, влияющие на уровень иммунной защиты при пневмонии в условиях оксидантной нагрузки 145
Заключение 149
Выводы 165
Рекомендации по использованию научных выводов и перспективы дальнейших исследований 167
Список принятых сокращений 168
Список литературы
