Введение
Глава 1 Методы определения токсинов патогенных бактерий 13
Глава 2 Материалы и методы 29
2.1 Объекты исследования 29
2.1.1 Штаммы микроорганизмов 29
2.1.2 Антигены 29
2.1.3 Реактивы, питательные среды 33
2.1.4 Растворы
2.1.4.1 Насыщенный раствор сернокислого аммония 35
2.1.4.2 0,2 М карбонат-бикарбонатный буфер рН 9,0±0,5 35
2.1.4.3 Натрий-ацетатный буфер 0,001 моль/л рН 4,2±0,2 35
2.1.4.4 Цитратный буферный раствор 0,05 моль/л рН 4,2±0,2 35
2.1.4.5 Буферы для электрофореза
2.1.5 Клеточные линии 35
2.1.6 Лабораторные животные 36
2.2 Микробиологические методы 36
2.2.1 Культивирование микроорганизмов 36
2.2.2 Культивирование холерных вибрионов для индукции холерного токсина в соответствии с рекомендациями CDC
2.2.3 Подготовка проб 37
2.2.3.1 Приготовление бактериальных взвесей 37
2.2.3.2 Подготовка проб биологического материала, искусственно контаминированного возбудителем холеры и гетерологичными микроорганизмами
2.3 Метод получения антителопродуцирующих гибридом 38
2.3.1 Гибридизация 38
2.3.2 Клонирование гибридом 39
2.3.3 Получение иммуноасцитических жидкостей, содержащих МКА 39
2.3.4 Криоконсервация гибридом 40
2.4 Методы по получению и характеристике иммуноглобулинов 40
2.4.1 Выделение иммуноглобулинов 40
2.4.2 Электрофорез в полиакриламидном геле 41
2.4.3 Определение концентрации белка 41
2.4.4 Изотипирование иммуноглобулинов 42
2.4.5 Определение константы аффинности 42
2.4.6 Определение индекса аддитивности (эпитопный анализ) 42
2.4.7 Получение конъюгата иммуноглобулинов с пероксидазой хрена 43
2.5 Методы иммуноанализа 43
2.5.1 Непрямой вариант ИФА 43
2.5.2 Прямой вариант ИФА 44
2.5.3 «Сэндвич»-вариант ИФА 45
2.5.4 Определение ХТ методом ELISE-GM1 45
2.6 Статистическая обработка полученных данных 46
Глава 3 Получение моноклональных антител, специфичных к холерному токсину
3.1 Разработка эффективной схемы иммунного ответа для синтеза мышиных холерных антитоксических антител
3.2 Оптимизация процедуры гибридизации миеломных клеток и спленоцитов гипериммунных сингенных мышей
3.3 Создание клонотеки стабильных антителопродуцирующих гибридом 51
3.4 Характеристика полученных моноклональных антител 53
Глава 4 Разработка комплексного методического подхода для 58 идентификации токсигенных штаммов холерного вибриона
4.1 Разработка сэндвич-варианта ИФА с применением МКА для определения холерного токсина
4.2 Усовершенствование схемы культивирования токсигенных штаммов 64
V. cholerae
Глава 5 Конструирование моноклональной иммуноферментной тест-системы для идентификации токсигенных штаммов холерного вибриона и определение ее диагностической ценности
5.1 Комплектация иммуноферментной тест-системы, учет результатов 70
5.2 Оценка чувствительности и специфичности созданной тест-системы в рамках лабораторных испытаний
5.3 Результаты клинических испытаний 78
Заключение 86
Выводы 92
Список использованной литературы
