Введение
1.1 Криоконсервирование - сохранение биологического материала при помощи сверхнизких температур 9
1.1.1 Развитие методов криоконсервирования 10
1.1.2. Классификация криопротекторов 11
1.1.3. Естественные способы устойчивости к низким температурам и криопротекторы 12
1.1.4. Кржоконсервация морских животных 13
1.1.5. Криопротекторы на основе липидов 14
1.1.6. Жизнеспособность, целостность и функциональная активность в популяция клеток после замораживания-оттаивания 15
1.2. Культуры клеток в морской биотехнологии 16
1.2.1. Продукция биологически-активных веществ в культуре клеток .... 16
1.2.2 Культуры клеток морских беспозвоночных 19
1.2.3. Увеличение пролиферативной активности клеток морских
беспозвоночных с помощью белковых активаторов 22
1.2.3.1. Факторы роста морских ежей 22
1.2.3.2. Новый подход для увеличения пролиферативной
активности клеток морских беспозвоночных 23
1.2.3.3. Gal4 - представитель универсальных
активаторов транскрипции эукариотических генов 23
1.23 А. Возможность цис-регуляции гена ЭРФ морских ежей
белком Gal4 25
1.3. Перенос экзогенной ДНК в морской биотехнологии 26
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 28
2.1. Животные 28
2.2. Плазмиды 28
3. МЕТОДЫ 28
3 1 Приготовление препаратов липидов 28
3.2. Замораживание клеточной суспензии 29
3.3. Оттаивание клеточных культур 29
3.4. Дифференциальная сканирующая калориметрия лилидов 30
3.5. Трансфекция эмбрионов морских ежей 30
3.6. Получение первичных культур из клеток морских беспозвоночных . .30
3.7. Фракционирование суспензии эмбриональных клеток морских ежей 31
3.8. Трансфекция первичных клеточных культур, полученных из эмбрионов морских ежей со стадии бластулы 31
3.9. Выделение тотальной ДНК из эмбриональных клеток морских ежей ... 32
3.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием тотальной ДНК, выделенной из эмбриональных клеток морских ежей 32
3.11. Выделение тотальной РЬЖ из эмбрионов морских ежей и ее очистка ... 34
3.12. Получение фракции матричной РНК 35
3.13. ОТ-ПНР анализ 36
3.14. Рестрикционный анализ продуктов амплификации 36
3.15. Включение Н3-тимидина 37
3.16. Включение С14-уридина 37
3.17. Фотосъемка 38
3.18. Приготовление полутонких срезов 38
3.19. Выделение и определение содержания нафтохиноновых
пигментов из клеток первичных культур морского ежа 38
3.20. Статистический анализ 39
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 40
4.1. Эмбриональное развитие морского ежа и мидии 40
4.2. Криосохранение эмбриональных и соматических клеток
морских беспозвоночных 41
4.2.1. Жизнеспособность личиночных и соматических клеток моллюсков и эмбриональных клеток морских ежей после замораживания-оттаивания 41
4.2.2. Уровень синтеза РНК в первичных культурах личиночных и соматических клеток моллюсков и эмбриональных клеток морских ежей после замораживания-оттаивания 44
4.2.3. Температуры фазовых переходов общих липидных экстрактов морских беспозвоночных 47
4.2.4. Особенности замораживания-оттаивания клеток морских беспозвоночных 49
4.3. Влияние активатора транскрипции gal4 на рост и развитие эмбрионов и эмбриональных клеток морских ежей 52
4.3.1. Трансфекция оплодотворенных яйцеклеток и эмбрионов морских ежей геном gal4 52
4.3.2. Детекция генов, гомологичных генам цитоплазматических актинов СуПЪ и СуШЬ морского ежа St. purpuratus в клетках морских ежей при помощи геноспецифической ПЦР 54
4.3.3. Детекция гена gal4 в эмбриональных клетках морских ежей при помощи геноспецифической ПЦР 55
4.3.4. Экспрессия гена, гомологичного гену цитоплазматического актина Cyllb St. purpuratus в клетках плоского морского ежа 56
4.3.5. Доказательство экспрессии гена gal4 57
4.3.6. Рестрикционный анализ ггродуктов амплификации 58
4.3.7. Количество эмбрионов с ОПС у разных видов морских ежей ... 59
4.3.8. Количество эмбрионов с окрашенными ОПС у разных видов морских ежей . 61
4.3.9. Образование ОПС в процессе культивирования эмбрионов морских ежей 62
4.3 Л0. Влияние количества плазмидной ДНК на образование эмбрионов с ОПС у морских ежей 63
4.4. Очистка эмбриональньк клеток морских ежей фракционированием в ступенчатом градиенте плотности перколла 64
4.5. Влияние ингибиторов киназ и фосфотаз на развитие эмбрионов морских ежей 67
4.6. Пролиферативная активность клеток морских ежей, трансформированных геном gal4 70
4.6.1. Трансфекция первичных клеточных культур морских ежей геном gal4 70
4.6.2. Клеточные культуры, полученные из трансфецированных геном gal4 эмбрионов морских ежей 73
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 77
ВЫВОДЫ 79
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 80
