Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Агрегация белков 8
1.2. Общая характеристика белков теплового шока 11
1.3. Малые белки теплового шока 13
1.4. а-Кристаллин: структура, свойства и шапероноподобная функция 13
1.4.1. Сравнение структуры а-кристаллина и малых белков теплового шока 15
1.4.2. Олигомерная структура а-кристаллина 18
1.4.3. Стабильность а-кристаллина 20
1.4.4. Шапероноподобная активность а-кристаллина. Подавление агрегации белков а-кристаллином 21
1.5. р-Кристаллин хрусталика глаза быка: структура, термостабилыюсть 25
1.5.1. Влияние УФ-облучения на структуру и агрегацию р-кристаллина 27
1.6. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из мьшщ кролика: структура, термостабильность 28
1.7. Транскетолаза из Saccharomyces cerevisiae: структура, термостабильность 30
1.8. Алкогольдегидрогеназа I из Saccharomyces cerevisiae: структура, термостабильность 32
Глава 2. Материалы и методы 38
2.1. Материалы 38
2.1.1.Вьщелениеиочисткаа-иР-кристаллинов 38
2.1.2. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа 38
2.1.3. Транскетолаза из Saccharomyces cerevisiae 39
2.1.4. Очистка алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae 39
2.1.5. Рекомбинантный шаперон GroEL 39
2.2. Методы , 40
2.2.1. Электрофоретический анализ в ПААГ 40
2.2.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) 40
2.2.3. Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС) 41
2.2.4. Изучение кинетики тепловой агрегации и ассоциации белков методом ДЛС , 44
2.2.5. Аналитическое ультрацентрифугирование 45
2.2.6. Определение активности глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы 45
2.2.7. Термоинактивация глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы 46
2.2.8. Определение активности алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae 46
2.2.9. УФ-обдучение Р-кристаллина 47
Глава 3. Результаты и обсуждение 49
3.1. Исследование стабильности а-кристаллина в процессе нагревания 49
3.2. Тепловая денатурация и агрегация pL-кристаллина 55
3.2.1. Электрофррез препарата pL-кристаллина в ПААГ 55
3.2.2. Седиментационный анализ препарата Рь-кристаллина 55
3.2.3. Тепловая денатурация PL-кристалина в отсутствие и в присутствии а-кристаллина 56
3.2.4. Кинетика тепловой агрегации Рь-кристаллина . 57
3.2.5. Влияние а-кристаллина на кинетику агрегации PL-кристаллина 65
3.2.6. Агрегация УФ-облученного Рь-кристаллина. Влияние а-кристаллина 73
3.3. Тепловая денатурация и агрегация глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (ГАФД) 77
3.3.1. Тепловая денатурация ГАФД 77
3.3.2. Седиментационный анализ ГАФД 78
3.3.3. Исследование кинетики агрегации ГАФД при различных температурах 80
3.3.4. Зависимость кинетики агрегации ГАФД от концентрации белка при 55 С 83
3.3.5. Корреляция между тепловой агрегацией и инактивацией ГАФД 86
3.3.6. Корреляция между тепловой денатурацией и агрегацией ГАФД 87
3.3.7. Влияние а-кристаллина на тепловую денатурацию ГАФД 91
3.3.8. Седиментационный анализ ГАФД в присутствии а-кристаллина 92
3.3.9. Влияния а-кристаллина на процесс тепловой инактивации ГАФД 93
3.3.10. Влияние а-кристаллина на кинетику тепловой агрегации ГАФД при 45 и 55 С 95
3.3.11. Влияние а-кристаллина на тепловую агрегацию ГАФД при нагревании с постоянной скоростью 105
3.3.12 Влияние GroEL на кинетику тепловой агрегации ГАФД при 45 С 114
3.4. Тепловая агрегация транскетолазы из Saccharomyces cerevisiae 120
3.4.1. Кинетика агрегации магниевой и кальциевой форм холофермента ТК при нагревании с постоянной скоростью 120
3.4.2. Кинетика агрегации магниевой и кальциевой форм холофермента ТК при постоянной температуре 122
3.5. Тепловая денатурация и агрегация алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae 127
3.5.1. Тепловая денатурация алкогольдегидрогеназы 127
3.5.2. Тепловая денатурация алкогольдегидрогеназы в присутствии а-кристаллина 130
3.5.3. Кинетика тепловой агрегации алкогольдегидрогеназы 130
3.5.4. Влияние а-кристаллина на кинетику агрегации алкогольдегидрогеназы 138
3.5.5. Влияние а-кристаллина на тепловую агрегацию АДГ І в режиме нагревания с постоянной скоростью 142
3.5.6. Корреляция между тепловой денатурацией и агрегацией АДГ 1 145
3.5.7. Моделирование трехмерной структуры АДГ I из Saccharomyces cerevisiae 147
Заключение..., 150
Выводы 154
Список литературы 156
