Введение
Обзор литературы 16
1. Фосфатсодержащие противоопухолевые липиды 16
1.1.Эдельфозин 17
1.2. Илмофозин 19
1.3.Милтефозин 20
1.4.Перифозин 22
1.5.Эруфозин и эрицилфосфохолин 23
2. Бесфосфорные глицеролипиды алкильного типа с положительно 25 заряженным полярным доменом
3. Апоптотическая гибель опухолевых клеток при действии фосфатсодержащих липидов 30
3.1.Механизм действия эдельфозина и его аналогов,
опосредованный изменениями цитоплазматической мембраны 31
3.2. Механизм действия эдельфозина и его аналогов, опосредованный локализацией в эндоплазматическом ретикулуме 36
3.3.Развитие митохондриального пути апоптоза при действии фосфатсодержащих противоопухолевых липидов 38
4. Механизмы гибели опухолевых клеток 39
4.1.Рецептор-опосредованный (внешний) апоптоз 40
4.2.Митохондриальный (внутренний) апоптоз. Каспазозависимый и каспазонезависимый пути 42
4.3. Некроз, регулируемый некроз, некроптоз 45
4.4.Аутофагия 46
4.5. «Митотическая катастрофа» 47
4.6. Аноикис 48
4.7. Энтоз 48
4.8. Партанатоз 49
5. Протеинкиназы как возможные мишени противоопухолевых липидов 49
5.1.Протеинкиназы С 50
5.2. Протеинкиназа Met 53
5.3. Протеинкиназа Src 54
5.4. Киназа инсулинового рецептора 56
5.5. Протеинкиназа Pim-1
5.6 Материалы и методы исследования
1. Культивируемые клеточные линии 59
2. Препараты для исследований 59
3. МТТ-тест для исследования цитотоксичности 61
4. Исследование действия липидов на лимфоциты 61
5. Исследование способности липидов повреждать мембрану эритроцитов 62
Исследование способности липидов повреждать смоделированную мембрану липосом
Окраска клеток пропидия иодидом для исследования изменений клеточного цикла 63
8. Обратная транскрипция и ПЦР (RT-PCR) 63
9. ПЦР в реальном времени (Realime PCR) 65
10. Определение белков методом иммуноблоттинга 66
11. Окрашивание клеток аннексин V- пропидия иодид 68
12. Исследование межнуклеосомной деградации ДНК 68
13. Проверка изменения межмембранного потенциала митохондрий при действии липидов 69
14. Наблюдение локализации флуоресцентно-меченного липида в клетке 70
15. Накопление липида 6FL в клетках С6 70
16. Исследование способности липидов к ингибированию
протеинкиназ в тест-системе Streptomyces lividans aphVIII+ 70
17. Скрининг протеинкиназ как возможных мишеней действия ипидов 71
18. Исследование влияния липидов на функционирование
топоизомеразы I 71
19. Определение параметров связывания липид-ДНК 72
20. Моделирование возможного взаимодействия липидов с ДНК и топоизомеразой I 73
Результаты исследования и обсуждение 76
1. Исследование цитотоксичности катионных глицеролипидов 79
2. Исследование способности липидов повреждать мембрану
эритроцитов и смоделированную мембрану липосом 83
3. Исследование изменений клеточного цикла 85
3.1. Окраска клеток пропидия иодидом 85
3.2. Изучение влияния катионных липидов на уровень p21waf1/cip1 86
4. Определение типа гибели опухолевых клеток при действии катионных липидов 89
4.1. Окрашивание клеток аннексин V- пропидия иодид 89
4.2. Исследование межнуклеосомной деградации ДНК 91
4.3. Определение роли процессированного PARP и каспаз 3, 9, 12 в апоптозе, индуцированном липидами 91
4.4. Проверка изменения межмембранного потенциала митохондрий при действии липидов 93
4.5. Исследование влияния р53 на апоптоз, опосредованный действием липидов 95
5. Поиск мишеней действия липидов 96
5.1. Наблюдение локализации флуоресцентно-меченного липида в клетке 97
5.2. Скрининг протеинкиназ как возможных мишеней для липида 100
6. Поиск потенциальных мишеней для липидов при условии их модификации 101
6.1. Исследование влияния липидов на функционирование топоизомеразы I 102
6.2.Определение параметров связывания липид-ДНК 104
6.3. Моделирование возможного взаимодействия липидов с ДНК и топоизомеразой I 106
Заключение 110
Выводы 113
Благодарности 114
Список использованной литературы
