Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Функции и молекулярные механизмы действия интерферонов 10
2.1.1. Классификация и структура интерферонов (IFN) 10
2.1.2. Действие IFN на клетки 11
2.1.2.1. Антивирусная активность IFN 11
2.1.2.2. Антибактериальная активность IFN 12
2.1.2.3. Противоопухолевая активность IFN 12
2.1.2.4. Иммуномодулирующая активность IFN 13
2.1.3. Молекулярный механизм передачи сигнала IFN 14
2.1.4. IFN-индуцируемые белки 16
2.2.7.1. 2,-5-олигоаденилат-синтетаза (2-5AS) и РНКаза L 16
2.2.7.3. Индоламин-2,3-диоксигеназа (IDO) 18
2.2. Триптофанил-трнк-синтетазa (WRS) 19
2.2.1. Структура WRS млекопитающих 19
2.2.2. Каноническая активность WRS - синтез триптофанил-тРНК 22
2.2.3. Неканонические активности WRS 23
2.2.4. Ген WRS человека и регуляция его экспрессии под действием интерферона 25
2.2.5. Способность WRS к синтезу Ар3А и роль АрзА в клеточном ответе на IFN 29
2.3. Регуляция клеточного цикла З О
2.3.1. Циклин-зависимые киназы (CDK) - основные регуляторы клеточного цикла 30
2.3.2. Фосфорилирование CDK 34
2.3.3. Субстраты CDK 3 5
2.3.4. Ингибиторы циклин-зависимых киназ (СКІ) 37
2.3.5. Контроль клеточного цикла и онкогенез 42
2.3.6. Молекулярные механизмы влияния IFN на клеточный цикл 43
3. Материалы и методы 49
3.1. Реагенты 49
3.2. Проверка чистоты используемых материалов 49
3.3. Определение концентрации белка 49
3.4. Аналитическая гель-фильтрация и ионообменная хроматография 50
3.5. Электрофорез 50
3.6. Определение активности WRS в реакции аминоацилирования тРНК 51
3.7. Выделение рекомбинантного WRS человека 51
3.8. Антитела и антисыворотки, очистка поликлональных антител (пАТ) 52
3.9. Иммуноблотгинг 53
3.10. Иммунопреципитация белков 53
3.11. Ингибирование киназной активности CDK 54
3.12. Клеточные культуры 55
3.13. Получение клеточных экстрактов 55
3.14. Конструкция антисмысловой WRS и трансфекция клеток человека 55
3.15. Анализ пролиферативной активности клеток с помощью изотопного мечения 56
3.16. Анализ мРНК методом Нозерн-гибридизации 56
4. Результаты и их обсуждение 58
4.1. Влияние модуляторов активности протеинкиназ на экспрессию гена wrs человека 58
4.1.1. Влияние IFNy и активатора протеинкиназы С (РКС) на содержание WRS в клетках человека 58
4.1.2. Влияние ингибиторов РКС на экспрессию WRS 63
4.1.3. Возможные механизмы активации экспрессии гена WRS человека протеинкиназой С 68
4.1.4. Индукция WRS протеинкиназой С объясняет повышение уровня АрзА в ответ на РМА 70
4.1.5. Взаимосвязь некоторых РКС- и IFN-регулируемых белков 71
4.2. Исследование механизмов взаимодействия wrs с cdk в ходе клеточного ответа на IFNy 75
4.2.1. Изучение влияния WRS человека на активность протеинкиназ 75
4.2.2. Исследование механизма ингибирования киназ семейства CDK 79
4.2.3. Влияние WRS на связывание CDK с циклинами 83
4.3. Исследование роли WRS в антипролиферативной активности IFNy 87
4.3.1. Возможная роль WRS в регуляции клеточного цикла интерфероном 87
4.3.2. Влияние WRS на антипролиферативное действие IFNy 89
4.3.3. Роль различных ингибиторов CDK в антипролиферативной активности IFNy 95
5. Выводы 101
6. Список литературы 102
