Введение
2. Обзор литературы 17
2.1. Системы гетерологической экспрессии белков в клетках млекопитающих с высоким выходом 17
2.1.1. Промышленно пригодные методы культивирования клеток млекопитающих 25
2.2. Фактор VII свертывания крови 26
2.3. Фактор VIII свертывания крови 28
2.3.1. Полноразмерный рекомбинантный фVIII 28
2.3.2. Рекомбинантный фVIII с делецией B-домена 30
2.3.3. Лекарственные препараты фVIII пролонгированного действия 34
2.3.4. Факторы, ограничивающие продуктивность систем гетерологической экспрессии фVIII 2.4. Фактор IX свертывания крови человека. 37
2.4.1. Заместительная терапия гемофилии В 38
2.4.2. Рекомбинантный фIX 39
2.4.3. Структура и пост-трансляционные модификации фIX 40
2.4.4. Улучшения процессов получения рекомбинантного фIX 44
2.4.5. Возможности и ограничения методов получения фIX в трансгенных организмах 45
2.4.6. Измененные варианты рекомбинантного фIX для клинического применения 48
2.4.7. Потенциал и границы возможностей генотерапии гемофилии B 51
2.4.8. Возможные пути повышения продуктивности систем экспрессии фIX в клетках CHO 56
2.5. Фолликулостимулирующий гормон человека 59
2.5.1. Биосинтез, секреция и транспорт ФСГ 60
2.5.2. Роль олигосахаридных групп в функционировании ФСГ 61
2.5.3. Рецептор ФСГ, общая схема передачи сигнала 63
2.5.4. Биологические функции ФСГ 63
2.5.5. Рекомбинантный ФСГ для клинического применения 65
2.5.6. Продуктивность существующих систем биосинтеза ФСГ и возможности по ее увеличению 66
2.6. Лютеинизирующий гормон человека 69
2.7. Конъюгаты полипептидов с полисиаловой кислотой как искусственные гликопротеиды 74
2.7.1. Способы химической модификации инсулина 74
2.7.2. Оксинтомодулин 75
3. Материалы и методы 77
3.1. Методы работы с ДНК 77
3.1.1. Общие методы работы с ДНК 77
3.1.2. Создание экспрессионных конструкций 82
3.1.3. Препаративное получение плазмид для трансфекции 91
3.2. Методы работы с бактериями Escherichia coli 91
3.3. Методы работы с культурами клеток млекопитающих 93
3.3.1. Трансфекция и культивирование транзиентно трансфицированных клеток 93
3.3.2. Получение стабильно трансфицированных клеток 94
3.3.3. Создание моноклональных линий-продуцентов 94
3.3.4 Клонирование методом предельных разведений 95
3.3.5. Получение клональных продуцентов фIX 95
3.3.6. Получение стабильно трансфицированных популяций клеток при использовании пар векторов с маркерами устойчивости DHFR и GS. 96
3.4. Методы анализа продуцентов 96
3.4.1. Выделение геномной ДНК 96
3.4.2. Выделение РНК и получение кДНК 97
3.4.3. ПЦР в реальном времени 97
3.4.4. Саузерн-блот гибридизация 100
3.4.5. Иммуноферментный анализ 100
3.4.6. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ) 101
3.4.7. Количественное определение белка 102
3.4.8. Иммуноблоттинг 102
3.4.9. Изоэлектрическое фокусирование 103
3.4.10. Коагулометрия 104
3.4.11. Ферментативная кинетика 104
3.4.12. Измерение концентрации флуоресцентных белков и проточная цитофлуориметрия 104
3.4.13. Модификации состава культуральной среды при культивировании линии-продуцента фVIII 105
3.5. Очистка и характеризация продуктов 106
3.5.1. Хроматографическая очистка фVIII 106
3.5.2. Выделение и очистка фIX 108
3.5.3 Хроматографическая очистка ФСГ 108
3.5.4. Формулирование ФСГ-содержащего препарата 109
3.5.5. Определение примеси ДНК штамма-продуцента в очищенном препарате ФСГ 110
3.5.6. Определение родственных примесей (окисленных форм) в препарате ФСГ 111
3.5.7. Трипсинолиз ФСГ 111
3.5.8. Анализ сахаров 112
3.5.9. Резорциноловый метод определения сиаловой кислоты 112
3.5.10. Масс-спектрометрия 112
3.6. Получение мкАт 113
3.6.1. Получение мкАт к фVII 113
3.6.2. Получение мкАт к фVIII 118
3.7.Компьютерное моделирование 119
3.8. Методы анализа ФСГ в фармацевтических композициях. 120
3.9. Методы физико-химического анализа субстанции ФСГ 121
2.9.1 Определение первичной последовательности. 121
3.9.2. Изучение вторичной и третичной структуры 123
3.9.3. Определение состава N-гликанов 123
3.9.4. Определение биологической активности in vitro 124
3.10. Методы исследования ФСГ in vivo 125
3.10.1. Определение биологической активности in vivo 125
3.10.2. Острая токсичность. 125
3.10.3. Подострая токсичность. 126
3.11. Методы проведения клинического исследования ФСГ 127
3.12. Получение конъюгата инсулина и полисиаловой кислоты 128
3.13. Получение конъюгата оксинтомодулина с полисиаловой кислотой 130
3.13.1. Синтез конъюгата OXM с полисиаловой кислотой 130
3.13.2. Получение очищенного конъюгата 130
3.13.3. Химическое десиалирование PSA-OXM 131
3.13.4. Пептидное картирование при помощи протеазы Asp-N 131
3.13.5. Ограниченный протеолиз при помощи протеазы DPP-IV 132
3.13.6. Определение активности PSA-OXM на животной модели 132
4. Результаты исследования 133
4.1. Создание линии клеток-продуцентов фактора VII в клетках линии BHK при помощи стандартной векторной плазмиды 133
4.2. Создание линии продуцента фактора VIII c делецией B-домена на базе стандартной экспрессионной системы в клетках линии CHO 138
3.2.1. Создание экспрессионных конструкций делеционного мутанта фVIII 139
4.2.1. Получение и характеризация линии-продуцента BDD-фVIII 139
4.2.2. Получение мкАт для препаративной очистки фVIII 141
4.3. Дизайн генетических элементов для оригинальной системы экспрессии p.1.1 143
4.3.1. Получение минимального базового вектора pBL 143
4.3.2 Получение фланкирующих областей гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка 144
4.3.3. Получение экспрессионного вектора p.1.1 146
4.3.4. Проверка свойств вектора p1.1 для модельного белка eGFP 147
4.3.5. Получение совместимых c p1.1 экспрессионных векторов серии p1.2 150
4.4. Получение и характеризация линий-продуцентов BDD-фVIII на основе разработанной системы экспрессии 156
4.4.1. Изменение условий культивирования для увеличения концентрации фVIII в среде 161
4.4.2 Очистка и характеризация BDD-фVIII 165
4.4.3. Компьютерное моделирование, поиск синтетического лиганда для очистки фVIII 167
4.5. Ко-экспрессия гена целевого белка и вспомогательных генов на примере фактора свертывания крови IX 169
4.5.1. Получение и характеризация первичных линий-продуцентов фIX 169
4.5.2. Ко-экспрессия генов PACE/furin и VKORC1 171
4.5.3. Характеризация линии клеток 3B12-86 173
4.5.4. Выделение и очистка фIX 175
4.6. Ко-экспрессия пары генов, образующих гетеродимерный гликопротеин, при помощи трицистронного вектора, на примере ФСГ 176
4.6.1. Получение и характеризация клональных линий-продуцентов ФСГ 180
4.6.2. Получение очищенного ФСГ, пригодного для клинического применения 183
4.6.3. Характеризация очищенного ФСГ 184
4.6.4. Фармацевтическая композиция прототипа лекарственного средства ФСГ 192
4.6.5. Доклинические исследования субстанции ФСГ 193
4.6.6. Клиническое исследование лекарственного препарата ФСГ 195
4.7. Одновременная амплификация пары экспрессионных плазмид в геноме клеток продуцентов. Получение продуцентов лютеинизирующего гормона 198
4.7.1. Возможность ко-амплификации пары плазмид на примере модельных флуоресцентных белков 198
4.7.2 Многостадийная ко-амплификация пары плазмид на примере лютеинизирующего гормона человека 200
4.8. Создание искусственных гликопротеидов методом химической конъюгации с полисиаловой кислотой 204
4.8.1. Получение чистого препарата конъюгата инсулина и полисиаловой кислоты 204
4.8.2. Конъюгат оксинтомодулина и полисиаловой кислоты 207
4.8.3 Определение точки конъюгации при помощи пептидного картирования 209
4.8.4. Определение чувствительности к DPP-IV 212
4.8.5. Влияние PSA-OXM на общее потребление пищи в краткосрочном тесте 212
4.9. Механизм взаимодействия каталитических антител с фосфороорганическими субстратами 215
5. Обсуждение результатов 220
6. Заключение 232
7. Список литературы 235
8. Список сокращений 263
