Введение
1. История открытия, номенклатура и критерии МСК 18
1.1. История исследования МСК 18
1.2. Терминология 19
1.3. Методы выделения МСК 19
1.4. Минимальные критерии для идентификации МСК 20
2. Основные фенотипические и функциональные характеристики МСК 22
2.1. Поверхностный фенотип и профиль экспрессии генов 22
2.2. Секреторный профиль 24
2.3. Адгезивные свойства 24
2.4. Рост in vitro 26
2.4.1. Характеристика роста при культивировании в стандартных условиях 26
2.4.2. Старение и самоподдержание 27
2.4.3. Влияние факторов роста и условий культивирования на МСК in vitro 28
2.5. Потенции к дифференцировке 30
2.5.1. Остеогенез 30
2.5.2. Адипогенез 32
2.5.3. Хондрогенез 33
2.5.4. Дифференцировка в другие мезенхимные и мезодермальные производные.. 35
2.5.5. Дифференцировка в экто- и энтодермальные производные 38
2.5.6. Возможные механизмы пластичности 40
3. Структура популяции стромальных клеток 42
3.1. Гетерогенность популяции МСК 42
3.2. Возможная организация стромального дифферона 45
3.2.1. Коммитированные стромальные предшественники 45
3.2.2. Предполагаемые мезенхимные стволовые клетки 46
3.2.3. Общие предшественники стромальных и кроветворных клеток 47
3.2.4. Плюрипотентные клетки 48
4. Локализация и функции МСК в организме 51
4.1. Локализация МСК 51
4.1.1. Источники МСК в развивающемся и зрелом организме 51
4.1.2. Микроокружение МСК 55
4.1.3. Миграция МСК 58
4.2. Роль МСК в регенерации 60
4.2.1. Дифференцировка МСК in vivo 60
4.2.2. Трофическая активность 61
4.3. МСК кроветворных органов как клетки, организующие кроветворное микроокружение 63
4.3.1. Стромальная регуляция гемопоэза 64
4.3.1.1. Клеточный состав кроветворной стромы 64
4.3.1.2. Механизмы стромальной регуляции кроветворения 69
4.3.1.3. Роль МСК в поддержании кроветворения 72
4.3.2. Характеристика МСК из дефинитивных и транзиторных органов гемопоэза 74
4.3.2.1. Костный мозг 74
4.3.2.2. Печень 75
4.3.2.3. Селезенка 77
5. Проблемы использования МСК в регенеративной медицине 78
5.1. Подходы к клиническому использованию МСК 79
5.1.1. Системное введение 79
5.1.2. Локальная доставка в место повреждения 80
5.1.3. Тканевая инженерия 81
5.1.4. Генная терапия 82
5.2. Область применения МСК 84
5.2.1. Заболевания опорно-двигательного аппарата 84
5.2.2. Сердечно-сосудистые заболевания 84
5.2.3. Неврология 85
5.2.4. Гематология и онкология 86
5.2.5. Иммуноконфликтные состояния и аутоиммунные заболевания 87
5.2.6. Другие заболевания 87
5.3. Проблемы и возможные риски применения МСК в клинике 88
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 91
1. Экспериментальные животные 91
2. Культивирование клеток 91
2.1. Выделение клеток из тканей 91
2.2. Первичные и пассируемые культуры стромальных клеток 91
2.3. Анализ адгезивных свойств стромальных и миогенных предшественников 92
2.4. Обработка клеток 5-фторурацилом 93
2.5. Индукция дифференцировки МСК in vitro 93
2.6. Совместное культивирование различных клеточных популяций 94
2.7. Культивирование МСК на носителях 94
3. Эксперименты in vivo 95
3.1. Эктопическая трансплантация печени зародышей 95
3.2. Трансплантация клеток в диффузионных камерах 95
3.3. Трансплантация клеток на носителях 95 4. Анализ результатов 96
4.1. Морфологические исследования 96
4.2. Цитохимические исследования 96
4.3. Иммуноцитохимические исследования 97
4.4. Выявление никотиновых холинорецепторов с помощью -бунгаротоксина 97
4.5. Молекулярно-генетический анализ 97
4.6. Количественный анализ и статистическая обработка результатов 98
ГЛАВА 3. Результаты и Обсуждение 100
1. Характеристика клонального роста МСК в первичной культуре 100
1.1. Содержание клоногенных МСК в популяциях клеток кроветворных
органов крысы и мыши в пре- и постнатальном онтогенезе 100
1.2. Морфология и клеточный состав колоний, образуемых КОЕ-Ф 103
1.3. Сравнительная оценка остеогенных потенций КОЕ-Ф из кроветворных органов в ходе онтогенеза на основании активности
щелочной фосфатазы в клетках колоний 106 1.4. Антигенный фенотип клеток колоний: экспрессия маркеров МСК 110
2. Гетерогенность клеточного состава стромы зародышевой печени 114
2.1. Миофибробласты 115
2.1.1. Морфология миофибробластоподобных клеток и экспрессия ими десмина 115
2.1.2. Экспрессия специфических маркеров миофибробластов
различного происхождения 116
2.2. Колонии черепицеобразных клеток 118
2.2.1. Численность и морфология колоний, содержащих черепицеобразные клетки 118
2.2.2. Экспрессия маркеров эпителиальных и эндотелиальных клеток 120
2.3. Скелетно-мышечные элементы 122
2.3.1. Морфология и фенотип спонтанно образующихся миотуб 122
2.3.2. Функциональные характеристики миотуб 124
2.3.3. Адгезивные свойства предшественников миотуб 126
2.3.3.1. Адгезия миогенных предшественников к белкам внеклеточного матрикса 126
2.3.3.2. Содержание миогенных предшественников
в субпопуляциях клеток, различающихся по срокам прикрепления к пластику 127
3. Характеристика МСК в монослое при последовательном
пассировании (субкультивировании) 128
3.1. Оценка пролиферативной активности пассируемых клеток стромы кроветворных органов на основании экспрессии антигена Ki-67 129
3.2. Морфология и фенотип пассируемых стромальных клеток 130
3.2.1. Морфологические изменения клеток в ходе пассирования 130
3.2.2. Оценка содержания остеогенных клеток в пассируемых культурах
на основании активности щелочной фосфатазы 132
3.2.3. Антигенный фенотип пассируемых клеток: экспрессия маркеров МСК 133
4. Дифференцировка МСК in vitro в индукционных средах 136
4.1. Остеогенез 136
4.1.1. Остеогенная дифференцировка в стандартной индукционной среде 136
4.1.1.1. Костный мозг 136
4.1.1.2. Печень зародышей 139
4.1.1.3. Селезенка 142
4.1.2. Остеогенная дифференцировка под влиянием факторов роста 144
4.1.2.1. Влияние bFGF и BMP-2 на дифференцировку МСК в остеогенной среде 144
4.1.2.2. Совместное культивирование МСК костного мозга и зародышевой печени в остеогенной среде 146
4.2. Адипогенез 147
4.2.1. Адипогенная дифференцировка в стандартной индукционной среде 147
4.2.1.1. Костный мозг 147
4.2.1.2. Печень зародышей 148
4.2.1.3. Селезенка 150
4.2.2. Адипогенная дифференцировка, наблюдаемая при культивировании МСК в среде без индукторов и в остеогенной среде 151
4.3. Хондрогенез 153
4.3.1. Костный мозг 154
4.3.2. Печень зародышей 155
4.3.3. Селезенка зародышей 157
4.4. Миогенез 158
4.4.1. Костный мозг 158
4.4.2. Печень зародышей 159
5. Сравнительный анализ субпопуляций МСК, различающихся по чувствительности к 5-фторурацилу 162
5.1. Чувствительность КОЕ-Ф печени зародышей и костного мозга половозрелых крыс к цитотоксическому действию 5-фторурацила 162
5.2. Остеогенные и адипогенные потенции субпопуляций МСК, различающихся по чувствительности к 5-фторурацилу 164
6. Влияние компонентов внеклеточного матрикса на клональный рост и дифференцировку МСК 169
6.1. Клональный рост МСК на компонентах внеклеточного матрикса 169
6.1.1. Содержание КОЕ-Ф в популяциях клеток костного мозга и зародышевой печени, различающихся по скорости прикрепления к фибронектину, коллагену I типа и ламинину 169
6.1.2. Эффективность клонирования МСК костного мозга при культивировании на фрагментах фибронектина 172
6.2. Влияние адгезии к белкам внеклеточного матрикса на остеогенную дифференцировку МСК костного мозга 174
6.2.1. Остеогенная дифференцировка МСК при культивировании на фибронектине, коллагене I типа и ламинине 174
6.2.2. Остеогенная дифференцировка МСК на фрагментах фибронектина 176
6.3. Адипогенная дифференцировка МСК при культивировании на фибронектине,
коллагене I типа и ламинине 178
7. Экспериментальные подходы к изучению дифференцировки МСК in vivo 180
7.1. Трансплантация МСК зародышевой печени в составе тканевых фрагментов 180
7.2. Трансплантация МСК в диффузионных камерах 183
7.2.1. Свежевыделенные клетки 183
7.2.2. Пассируемые МСК 185
7.3. Оценка пригодности различных материалов в качестве носителей для МСК 186
7.3.1. Биоматериалы на основе костного матрикса 187
7.3.2. Коллаген-хитозановая матрица 189
7.3.3. Гемостатическая коллагеновая губка 191
7.3.4. Криогели 192
7.3.4.1. Коллагеновый криогель 193
7.3.4.2. Криогели на основе агарозы 195
7.3.4.3. Криогель из диметилакриламида с привитой желатиной 197
Заключение 199
Выводы 207
Список сокращений 209
Список литературы
